宫颈癌是严重影响女性健康的一大杀手,是妇科恶性肿瘤患者最常见的死亡原因。虽然宫颈癌疫苗的应用能够有效减少宫颈癌的发生,但每年仍有约80%的新发病例和85%的死亡病例发生在发展中国家,并且其中超过70%的病例在诊断时已处于局部晚期,称为局部晚期宫颈癌。虽然目前宫颈癌的治疗方式已很全面—手术、化疗、放疗及免疫治疗等,但并不是所有患者都能获得较好疗效,尤其对于局部晚期宫颈癌患者疗效仍较差。对于局部晚期宫颈癌,目前的治疗方式是新辅助化疗后对化疗敏感患者采取手术治疗,不敏感患者直接转为放疗,如果有能有效预测患者对化疗敏感性的指标,这部分对化疗不敏感患者就可以免去新辅助化疗的时间及花费,直接转去放疗,得到更好疗效。因此,继续深入研究宫颈癌的发病机制,寻找特异性的治疗靶点以及预测化疗敏感性的标志物对于宫颈癌的治疗仍极为重要。生物信息学是一门交叉学科,随着人类基因组计划的完成,测序数据的爆炸式增长,应用生物信息学技术分析基因组数据之间的关系成为目前一大趋势,用于揭示疾病发生发展及耐药的分子机制。GEO数据库,是美国国立卫生研究院NCBI于2000年创建的公共数据库,是目前最大、最全面的公共基因表达数据资源。外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡,富含miRNA等物质,通过内吞、外排等作用调节机体多种生理或病理反应,参与肿瘤微环境的调节,还可以作为载体靶向传递药物至器官发挥作用等。在本研究中,近年的研究发现miR-451不仅参与肿瘤的发生进展,还参与肿瘤化疗敏感性的调控,相较于其他miRNA,miR-451更易于在外泌体中富集。基于以上研究背景,在本研究中,先使用生物信息学方法筛选在宫颈癌中差异表达的miRNA,结合文献筛选确定miR-451为研究对象,进一步分析其下游靶标及涉及的机制通路后,通过体外实验验证miR-451的生物学功能。近几年的研究表明miR-451可通过包裹于外泌体中影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,因此我们试验性在的在宫颈癌亲代及其耐药细胞株中研究了miR-451在预测宫颈癌化疗敏感性中的作用。本研究为寻找预测宫颈癌患者特异性治疗靶点及预测宫颈癌患者化疗敏感性的标志物提供理论及实验室依据,并为以外泌体作为治疗载体治疗宫颈癌提供了新的治疗思路。第一部分宫颈癌相关差异miRNA生物信息学研究目的:研究整理分析GEO中公共数据库中储存的宫颈癌miRNA数据集,筛选差异表达的miRNA基因,并对差异表达基因进行靶基因预测,ce RNA网络构建,GO功能注释,KEGG功能富集分析及PPI网络分析。为后续实验探索宫颈癌的发生进展的分子机制提供理论基础。方法:本研究以宫颈癌的相关芯片数据集作为研究对象,其中以正常样本作为对照,从GEO数据库中筛选出miRNA数据集GSE30656为研究对象,通过limma和affy包对质控后的RNA表达谱进行差异表达分析。在Pubmed中对差异miRNA逐个筛选,经过通读文献,对宫颈癌相关文献中已被证实及研究过的miRNA予以去除,确定下一步研究的目标miRNA。再针对目标miRNA进行靶基因预测,DAVID软件进行GO功能注释,KEGG功能富集分析,STRING在线数据库进行PPI网络分析。结果:1)本研究在宫颈癌中发现50个差异表达的miRNA,其中表达上调的21个,表达下调的29个。结合文献筛选,选取miR-451作为下一步实验验证的基因。2)针对于miR-451筛选到的m RNA基因进行功能富集分析,发现差异表达基因主要参与氮化合物代谢过程的调控、蛋白磷酸化过程的调控、RNA代谢过程的调控、细胞蛋白质代谢的调节等生物学功能。KEGG通路富集分析发现差异表达的基因主要集中在PI3K/AKT通路及m TOR等信号通路。结论:1)成功筛选出宫颈癌中差异表达的50个miRNA,包括21个上调的miRNA和29个下调的miRNA;结合文献检索筛选检出miR-451作为后续研究基因;2)对miR-451进行了lnc RNA-miRNA-m RNA ce RNA网络,并分析对其下游m RNA靶基因进行了GO功能富集分析与KEGG通路分析,以及对差异m RNA进行了PPI蛋白互作网络分析,为后续进行实验验证提供了基于宫颈癌组织测序数据分析的理论依据。第二部分:miR-451通过靶向MIF抑制宫颈癌细胞增殖迁移等功能目的:探讨miR-451通过靶向MIF对宫颈癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭及迁移能力的影响及其分子机制。方法:在Si Ha细胞中转染miR-451 NC/mimic,Ca Ski细胞中转染miR-451 NC/inhibitor后,CCK-8法检测miR-451对细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-451对细胞凋亡及周期的影响;细胞划痕实验检测miR-451对细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测miR-451对细胞侵袭能力的影响;荧光素酶报告实验验证MIF是miR-451的下游靶标;Western Blot法检测miR-451靶向MIF对下游PI3K/AKT/m TOR信号通路的调节。结果:1)miR-451在人宫颈癌细胞系中差异表达;2)在Si Ha细胞中过表达miR-451可对细胞产生抑制增殖、促进凋亡、阻滞周期、降低细胞迁移及侵袭能力的作用;在Ca Ski细胞中抑制miR-451表达可对细胞产生促进增殖、抑制凋亡、促进周期进展、促进细胞迁移及侵袭能力的作用;3)MIF为miR-451的下游靶标;4)miR-451的生物学功能是通过影响PI3K/AKT/m TOR通路实现的。结论:过表达miR-451可抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡、阻滞周期、降低细胞迁移及侵袭能力,抑制miR-451表达可促进宫颈癌细胞增殖、抑制凋亡、促进周期进展、促进细胞迁移及侵袭能力;其功能是通过靶向MIF及其下游PI3K/AKT/m TOR信号通路实现的。第三部分miR-451通过外泌体释放的形式维持宫颈癌细胞对顺铂的敏感性目的:研究miR-451在宫颈癌顺铂耐药中的作用,探索其功能是否是通过将miR-451包裹于外泌体中释放的形式实现的。方法:CCK-8法检测宫颈癌顺铂耐药株He La/DDP细胞及其亲代He La细胞的耐药指数;使用超高速离心法成功分离了两种细胞上清中的外泌体,通过电镜下观察形态、粒径大小检测、表面标记物检测鉴定外泌体;又定量分析了细胞及外泌体中miR-451的相对含量,进一步研究过表达或抑制miR-451后细胞IC50的变化及多药耐药基因MDR1的表达变化。结果:1)成功分离提取并鉴定了外泌体;2)miR-451在He La细胞中高表达,在其上清中低表达;miR-451在He La/DDP细胞中低表达,在其上清中高表达;3)在He La/DDP细胞中过表达miR-451后细胞对顺铂IC50明显下降,在He La细胞中抑制miR-451表达后细胞对顺铂IC50明显上调,提示miR-451可增强细胞对顺铂的敏感性;4)过表达miR-451后MDR1表达显著下调,提示He La/DDP细胞可能将抑癌基因miR-451包裹入外泌体中排出以维持细胞的耐药性。结论:miR-451可通过外泌体释放的形式影响宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性。