豆鼓产纤溶酶菌株的分离、鉴定及其基因的真核表达研究

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豆豉是中国传统的大豆发酵制品,从中提取出来的一种具有纤溶活性的酶,与从日本传统食品纳豆(natto)中提取出来的纳豆激酶同样具有溶解血栓的作用,且与传统的溶栓剂如链激酶、尿激酶等相比,具有纤溶作用强、安全性好、作用迅速、药效时间长、价格低廉等优点,同时对心脑血管疾病具有预防作用,其具有开发成新一代溶栓药物的潜力。 本文利用纤维蛋白平板法,从四川省富顺县生产的一种豆豉中分离出一株具有纤溶活性的细菌菌株。通过形态观察、生理生化特征分析和16S rDNA序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis),命名为DC10。16S rDNA序列测序结果表明,该菌株的16S rDNA片段为1453 bp,G+C含量为55%,在GenBank中的登录序号为EF474343。 以分离的枯草芽孢杆菌DC10的基因组DNA为模板,PCR扩增出豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到酿酒酵母/大肠杆菌穿梭质粒pYES2上,测序结果表明,扩增出的该豆豉纤溶酶基因片段长度为1158 bp,在GenBank中的登录序号为EF474344,克隆的核苷酸序列和氨基酸序列与NCBI上发表的纳豆激酶基因相应序列分别有98%和93%的同源性,证明本文得到的豆豉纤溶酶与纳豆激酶具有很高的相似度。 将重组表达载体pYES2-DFE(Douchi Fibrinolytic Enzyme)转化酿酒酵母H158感受念细胞,经β-半乳糖诱导表达。分别收集发酵液的上清和菌体破碎上清,经纤维蛋白平板法检测其纤溶活性,结果表明,发酵上清液有活性,而菌体破碎后的上清没有活性。
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