目的： （1）观察四个特异性TIMP-1小干扰RNA质粒转染HSC-T6细胞后对TIMP-1表达的抑制情况，并筛选出沉默靶基因TIMP-1效果最强的一个干扰质粒。 （2）探讨同时阻断MMPs-TIMPs系统和TGF-β/Smad7信号通路，是否比单一阻断其中一条通路抗纤维化作用更强。 方法： 1.质粒抽提、HSC-T6鉴定及质粒转染HSC-T6效率的检测：通过电泳及测序对抽提的TIMP-1siRNA（包含TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4、TIMP-1 shRNANON）、Smad7、反义TIMP-1重组质粒进行鉴定；运用荧光免疫技术检测HSC-T6细胞α-SMA蛋白的表达；质粒在脂质体介导下瞬时转染HSC-T6细胞48h后，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测质粒转染效率，明确转染效率最高的质粒与脂质体比例。 2.高效沉默TIMP-1的小干扰RNA表达质粒的筛选：采用转染效率最高的质粒与脂质体比例，将TIMP-1siRNA转染HSC-T6，经过G418筛选获得稳定表达HSC-T6细胞株，运用实时荧光定量PCR （real-time PCR）方法检测TIMP-1mRNA的表达，筛选出沉默靶基因TIMP-1效果最强的一个干扰质粒。 3.TIMP-1小干扰RNA、Smad7及反义TIMP-1重组质粒联合作用对HSC的影响：将筛选出的沉默TIMP-1效果最强的干扰质粒与Smad7质粒联合转染HSC-T6细胞，并与单独转染TIMP-1shRNA、Smad7、反义TIMP-1质粒组进行对比，通过real-time PCR技术检测以上各组TIMP-1、Smad7及a-SMA mRNA的表达，激光共聚焦定量分析a-SMA荧光强度的变化，观察联合转染组和单一转染组对HSC的影响。 结果： 1.经电泳及测序证实TIMP-1小干扰RNA、Smad7及反义TIMP-1重组质粒抽提成功；HSC-T6细胞荧光免疫结果显示：α-SMA蛋白表达阳性，阳性部位在胞浆，表明HSC-T6为表型活化的HSC；质粒转染细胞48h后，激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测结果显示：当质粒、脂质体比例（DNA/LIPO）为2μg/8μL时，转染效率最高，可达37％。 2.实时荧光定量PCR结果显示：TIMP-1四个特异性的小干扰RNA质粒中，TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达有较强的抑制作用，其中TIMP-1 shRNA1沉默靶基因效果最强。 3、TIMP-1 shRNA1、Smad7、及反义TIMP-1质粒联合转染后，与对照组相比，联合TIMP-1shRNA1+Smad7组、TIMP-1 shRNA1组、Smad7组、反义TIMP-1组这四组中的TIMP-1、a-SMA mRNA表达水平显著下调，Smad7mRNA表达水平显著上调，尤TIMP-1 shRNA1+ Smad7联合组最为明显（P<0.01）；激光共聚焦检测a-SMA蛋白水平变化与其转录水平的变化趋势一致。 结论： 1.α-SMA表达阳性是鉴定HSC活化的重要指标。 2.对于同一种细胞，质粒与脂质体比例不同，转染效率亦不同；激光共聚焦显微镜结合流式细胞仪可以快速、高效检测细胞转染效率。 3.TIMP-1小干扰RNA可以高效沉默靶基因的表达，特异性小干扰RNA序列不同，沉默靶基因的效率亦不同。 4.TIMP-1 siRNA、Smad7、反义TIMP-1重组质粒均能下调HSC激活信号，抑制ECM的合成，在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性。 5.同时阻断MMPs-TIMPs系统和TGF-β/Smad7信号通路，比单独阻断其中一条通路抗纤维化效果更强，TIMP-1 shRNA1联合Smad7有望成为治疗肝纤维化的手段。