本实验以采集于广东省大宝山的多年生禾本科草本植物香根草为材料，采用不同pH值及无氮培养基，结合乙炔还原法测定固氮酶活性，经平板划线法共分离筛选到47株内生固氮菌。利用全细胞蛋白电泳、DNA指纹图谱和唯一碳源利用对其进行聚类分析。在此基础上选取部分代表菌株进行如下研究：16S rDNA全序列测定，以确定菌株的系统发育；各菌株的生理生化特征；在不同环境因子(酸碱度、渗透压、铵离子以及碳源)下固氮菌株的固氮特性。 本研究再以从香根草中分离出的内生菌为材料，以桑格双脱氧链终止法为理论基础，首次通过遗传分析仪Li—COR4300聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对细菌的16S rDNA序列T碱基分布的特征进行聚类分析(以下简称“T碱基聚类”)，分别用全细胞蛋白电泳聚类、DNA指纹图谱聚类和唯一碳源利用聚类方法对T碱基聚类结果进行验证，以期能摸索出一种新的细菌聚类方法。 上述实验结果如下： 1.内生固氮菌的筛选分离：结合乙炔还原法，在无氮培养基及不同pH值(7.0和4.5)条件下，从香根草的茎和根中共分离出47株内生固氮菌。其中从根分离到8株，占17％；茎中分离到39株，占83％。各菌株之间的固氮酶活性差异很大，固氮酶活性在17.46 nmol C2H2 ml—1 h—1到1409.95 nmol C2H2 ml—1 h1之间。 2.聚类分析及系统发育：经全细胞蛋白电泳、DNA指纹图谱和唯一碳源利用以及“T碱基聚类”的聚类分析，在80％的水平上将47个菌株聚为6个类群。通过16SrDNA全序列分析知，类群Ⅰ中菌株xs1与Herbaspirillum frisingense亲缘关系最近，具有99％的相似性，属于草螺菌。类群Ⅱ的xs72与Pantoea ananatis的关系最近，有98％的相似性属于泛菌属。代表菌株xs322(类群Ⅴ)与洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、xs11(单个菌株)与Mitsuaria chitosanitabida、xs210(单个菌株)与中型假食酸菌(Pseudacidovorax intermedius)、xs43(类群Ⅲ)与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、xs71(单个菌株)与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、xs100(类群Ⅳ)与成团泛菌(Pantoea agglomerans)的相似性均为99％。菌株xr41(类群Ⅵ)与Enterobacter cloacae的相似性为97％，属于阴沟肠杆菌，可见香根草组织内存在多种内生固氮菌。 3.代表菌株的固氮特性：对代表菌株做了环境因子适应试验，测定其在不同环境条件下固氮酶活性，研究其对环境的适应性。结果表明，供试菌株在pH5.0～6.0、1.0％以下的盐分(NaCl)浓度以及2.5 mM NH4+浓度的处理下，具有较高的固氮酶活性；在不同碳源中，菌株的固氮酶活性差异较大；菌株对环境的适应能力较强。 4.T碱基聚类新方法：从香根草中分离出的47株内生固氮菌首次用T碱基聚类方法进行聚类分析，结果显示：T碱基聚类结果准确、可靠。相同的样品，SDS-PAGE全细胞蛋白质电泳、DNA指纹图谱、Bio—biqA试剂盒和T碱基聚类结果一致。T碱基聚类方法具有一次性检测数量大、速度快的特点，因此更适合对数量多的样品进行聚类分析；而代表菌株的16S rDNA全序列测定结果，又表明T碱基聚类新方法可以用于细菌的多样性分析。