目的通过比较研究PDE5-siRNA和iNOS单双基因在大鼠ADSCs中的表达效应,探讨PDE5-siRNA和iNOS基因修饰ADSCs应用于ED治疗的可行性和有效性。方法采用Ⅰ型胶原酶消化法原代培养SD大鼠ADSCs,并通过流式细胞术检测间充质干细胞相关免疫表型和定向多向诱导分化鉴定ADSCs。取第4代ADSCs,分别采用10μmol/L氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)荧光活性染料和50μmol/L5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)进行标记,分别于标记后第7天、14天、21天和28天通过流式细胞术和荧光显微镜比较研究CM-Dil和EdU对ADSCs的体外标记示踪效果。分别构建携带大鼠PDE5-siRNA的重组慢病毒载体(LV-PDE5-siRNA-GFP)和iNOS基因的重组腺病毒载体(Ad-iNOS-EGFP),并通过LV-PDE5-siRNA-GFP (MOI=70)和Ad-iNOS-EGFP (MOI=30)共转染第4代ADSCs,同时设立空白对照组(未转染组)、阴性对照组一(LV-NC-siRNA-GFP转染组)、阴性对照组二(Ad-NC-EGFP转染组)、阴性对照组三(LV-NC-siRNA-GFP+Ad-NC-EGFP共转染组)、阳性对照组一(LV-PDE5-siRNA-GFP转染组)、阳性对照组二(Ad-iNOS-EGFP转染组)。于共转染后3d、5d、7d、10d和14d,分别采用实时荧光定量PCR和Western Blot技术检测PDE5基因和iNOS基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。同时,分别采用硝酸还原酶法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定ADSCs中NO和cGMP浓度水平。结果培养的细胞阳性表达间充质干细胞免疫表型CD49d、 CD73、CD90、CD105和CD106而CD31、CD34和CD45为阴性表达,且成脂肪诱导分化细胞油红O染色阳性、成平滑肌诱导分化细胞共表达a-SMA和Desmin蛋白、成血管内皮诱导分化细胞vWF表达为阳性、成神经诱导分化细胞Nestin和NeuN表达阳性,而对照组均为阴性。实验组(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP共转染组)PDE5基因在mRNA水平和蛋白水平于共转染后3d明显下调,5-7d PDE5-siRNA干扰效率达到峰值,10d后开始降低,但第14天干扰效率仍维持较高水平,与阳性对照组-(LV-PDE5-siRNA-GFP转染组)间差异无统计学意义(P>0.05)；同时,腺病毒介导的iNOS基因于共转染24h后在mRNA水平和蛋白水平均显著上调,并于转染后5-7d达到峰值,10d后开始降低,14天后仍维持较高表达水平,其表达水平与阳性对照组二(Ad-iNOS-EGFP转染组)间差异无统计学意义(P>0.05)。共转染后3d、5d、7d、10d和14d,实验组(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP共转染组)和阳性对照组二(Ad-iNOS-EGFP转染组)NO浓度于转染后3d开始增加,5-7d达到峰值,于第10天出现降低后再呈增加趋势,至第14天仍维持较高浓度水平,且两组间差异无统计学意义(P>0.05)；实验组(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP共转染组)、阳性对照组一(LV-PDE5-siRNA-GFP转染组)和阳性对照组二(Ad-iNOS-EGFP转染组)cGMP浓度亦于转染后3d显著增加,5～7d达到峰值,于第10天后出现降低后再呈增加趋势,至第14天仍维持较高浓度水平,而实验组cGMP浓度显著高于两阳性对照组(P<0.01),但两阳性对照组间差异无显著统计学意义(P>0.05)。结论PDE5-siRNA和iNOS基因于ADSCs中同时对PDE5和iNOS基因表达发挥调控作用,并同时有效持续提高细胞内NO和cGMP浓度水平。因此,PDE5-siRNA和iNOS基因修饰的ADSCs于CM-Dil标记后有望在基因水平和组织学水平达到治疗ED目的,且将具有比无／单基因修饰的ADSCs更显著的疗效。第一部分大鼠脂肪干细胞的培养和鉴定目的体外分离培养大鼠ADSCs并进行鉴定,为PDE5-siRNA和iNOS基因修饰ADSCs移植治疗ED提供良好的种子细胞。方法取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪,采用Ⅰ型胶原酶消化法获取大鼠ADSCs,行传代培养,并取第4代细胞行CCK-8法测定细胞生长曲线。流式细胞术检测间充质干细胞免疫表型CD31、CD34、CD45、CD49d、 CD73、CD90、CD105和CD106表达情况初步鉴定ADSCs,再于成脂肪细胞、成平滑肌细胞、成血管内皮细胞和成神经细胞诱导培养基多向诱导分化不同时间后通过油红O染色、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和结蛋白(Desmin)、血管性血友病因子(vWF)、神经元核抗原(NeuN)和巢蛋白(Nestin)免疫荧光检测对诱导分化细胞进行鉴定。结果第4代大鼠ADSCs生长曲线呈“S”形,为标准的细胞生长曲线。所培养的细胞阳性表达间充质干细胞相关阳性免疫表型CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106,阳性率分别为(1.88±0.12)%、(4.05±0.13)%、(99.07±0.45)%、(4.68±0.23)%和(11.81±3.60)%,而造血干细胞表面分子CD34、CD45和血管内皮细胞表面分子CD31均为阴性表达,阳性率分别为(0.35±0.04)%、(0.38±0.01)%和(0.54±0.33)%。多向诱导分化鉴定显示,成脂肪诱导分化细胞油红O染色阳性,成平滑肌诱导分化细胞α-SMA和Desmin蛋白表达呈强阳性,成血管内皮诱导分化细胞vWF为阳性,成神经诱导分化细胞Nestin和NeuN表达阳性,对照组均为阴性,表明所培养的细胞具备多向诱导分化潜能。结论成功从大鼠脂肪组织中分离培养ADSCs,为PDE5-siRNA和iNOS基因修饰干细胞提供了理想的细胞载体,从而为PDE5-siRNA和iNOS基因修饰ADSCs移植治疗ED提供良好的种子细胞。第二部分大鼠脂肪干细胞的体外标记和示踪目的比较研究氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)荧光活性染料和5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)对大鼠ADSCs的体外标记示踪效果,为ADSCs移植治疗ED寻找最佳的干细胞示踪技术。方法取第4代大鼠ADSCs,分别采用2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、14μmol/L、16μmol/L、18μmol/L和20μmol/L CM-Dil不同标记浓度进行标记,通过流式细胞术和荧光显微镜筛选最佳标记浓度,并于最佳浓度标记后7d、14d、21d、28d和35d流式细胞术检测细胞阳性率及荧光强度。同时,50μmol/L EdU培养基分别标记ADSCs2h6^、12h、24h、48h、72h和96h,通过显色反应后于荧光显微镜下观察EdU标记不同时间的细胞阳性率,再于最佳标记时间标记后7d、14d、21d和28d检测EdU标记细胞阳性率。结果CM-Dil标记浓度达10μmol/L时,ADSCs即发生饱和,标记效率即可近达100%,且该浓度对ADSCs的生长状态无明显影响。10μmol/L CM-Dil于标记后第7天和第14天细胞阳性率较高,组间差异无统计学意义(P>0.05)；第21天后荧光逐渐衰减,细胞阳性率开始降低(P<0.05),第28天明显降低但阳性率仍达80%以上。50μmol/L EdU标记ADSCs48h其标记效率达到峰值为最佳标记时间,EdU标记后第7天细胞阳性率开始降低(P<0.01),第14天急剧下降,第28天细胞阳性率仅为(14.39±2.67)%。结论CM-Dil和EdU两者均可用于ADSCs标记、示踪,但CM-Dil标记具有操作简单、标记阳性率高、荧光持久等优点,适用于长期标记示踪,EdU仅适用于短期标记示踪。因此,CM-Dil标记示踪为ADSCs移植治疗ED的理想示踪技术。第三部分PDE5-siRNA和iNOS基因重组病毒载体的构建和鉴定一、PDE5-siRNA重组慢病毒载体的构建目的通过构建携带大鼠PDE5-siRNA的重组慢病毒载体(LV-PDE5-siRNA-GFP),为PDE5-siRNA植入ADSCs并稳定发挥干扰效应提供良好媒介。方法直接选用课题组前期研究有效的PDE5-siRNA序列(GCAGCCGAATTCTT-TGATC),并合成含有靶序列的双链DNA Oligo。采用限制性内切酶Hpa I和Xho I对pFU-GW-RNAi慢病毒载体进行双酶切使其线性化,再通过T4DNA连接酶将双链DNA Oligo与线性化的pFU-GW-RNAi慢病毒载体连接并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,然后单克隆菌落采用PCR法鉴定,PCR鉴定阳性的克隆进一步行测序鉴定和比对分析,比对正确的克隆即为构建正确的目的载体。将pFU-GW-PDE5-siRNA重组慢病毒载体、pHelper1.0和pHelper2.0’慢病毒辅助包装质粒三质粒共转染293T细胞,转染48h后,收集293T细胞上清,然后进行病毒扩增、浓缩和纯化,最后采用孔稀释法测定慢病毒滴度,即病毒滴度(TU/mL)=最后一孔GFP阳性细胞数/病毒原液量×(1E+3)。结果测序拼接序列中含有PDE5-siRNA序列(GCAGCCGAATTCTTTGATC)且匹配率为100%。1E+1μL、1E+OμL、1E-1μL、1E-2μL、1E-3μL、1E-4μL、1E-5μL1E-6μL和1E-7μL LV-PDE5-siRNA-GFP重组慢病毒稀释液转染293T细胞48h后,1E+1μL-1E-6μL转染孔均表达GFP,且GFP阳性细胞数随稀释倍数的增加而递减,1E-6μL转染孔仅检测到1个GFP阳性细胞,因此该病毒滴度为1E+9TU/mL。结论携带大鼠PDE5-siRNA的重组慢病毒载体构建成功且获得较高病毒滴度,可用于ADSCs的基因修饰研究。二、iNOS基因重组腺病毒载体的构建和鉴定目的通过构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的重组腺病毒载体,并观察由腺病毒介导的iNOS基因在293T细胞中的表达情况,为模拟iNOS基因在ADSCs中的表达提供可靠依据。方法采用PCR方法钓取和扩增大鼠iNOS基因并获取iNOS基因全长片段。通过Age I限制性内切酶酶切pDC315-EGFP腺病毒载体使其线性化。通过In-Fusion交换酶将纯化的iNOS基因PCR产物与线性化的pDC315-EGFP腺病毒载体进行定向克隆连接,将连接产物转化感受态细胞,并采用PCR法鉴定单克隆菌落,对于PCR鉴定阳性的克隆进一步行测序鉴定和BLAT比对分析。将构建正确的pDC315-iNOS-EGFP质粒转染293T细胞,并于转染后48h采用Western Blot技术检测iNOS基因在293T细胞中的表达情况。成功构建的pDC315-iNOS-EGFP质粒,利用AdMax腺病毒包装系统包装产生重组腺病毒,病毒粗提液反复感染HEK293细胞行病毒扩增,病毒粗提液通过Adeno-X腺病毒纯化试剂盒进行纯化,最后采用倍比稀释法测定病毒滴度。取不同体积病毒原液转染293T细胞,于转染48h后通过Western Blot技术检测iNOS基因在蛋白水平的表达情况。结果经PCR鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实pDC315-iNOS-EGFP重组腺病毒载体构建成功。重组腺病毒包装成功,且病毒滴度为1.2E+10PFU/mL。iNOS基因重组腺病毒转染293T细胞48h后,Western Blot检测到约154KDa大小的条带,其与iNOS/GFP融合蛋白分子量大小基本相一致,表明腺病毒介导的iNOS基因成功在293T细胞中正确表达。结论iNOS基因重组腺病毒载体构建成功且获得较高病毒滴度,为iNOS基因修饰ADSCs移植治疗ED奠定了良好的前期实验基础。第四部分PDE5-siRNA和iNOS基因在大鼠脂肪干细胞中的表达研究目的观察PDE5-siRNA和iNOS基因在大鼠ADSCs中的表达效应,探讨PDE5-siRNA和iNOS基因修饰ADSCs移植治疗ED的可能性和有效性。方法LV-PDE5-siRNA-GFP (MOI=70)和Ad-iNOS-EGFP (MOI=30)共转染第4代ADSCs,同时设立空白对照组(未转染组)、阴性对照组一(LV-NC-siRNA-GFP转染组)、阴性对照组二(Ad-NC-EGFP转染组)、阴性对照组三(LV-NC-siRNA-GFP+Ad-NC-EGFP共转染组)、阳性对照组-(LV-PDE5-siRNA-GFP转染组)和阳性对照组二(Ad-iNOS-EGFP转染组)。共转染后3d,采用Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒检测ADSCs凋亡情况,并于共转染第3天、5天、7天、10天和14天,分别采用实时荧光定量PCR和Western Blot技术检测PDE5和iNOS基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。同时,分别采用硝酸还原酶法和ELISA法测定ADSCs培养上清中NO浓度和细胞内cGMP浓度。结果实验组(LV-PDE5-siRNA-GFP+Ad-iNOS-EGFP）共转染组凋亡细胞比例为(3.04+0.58)%,与其他各组间差异无显著统计学意义(P>0.05)。实验组PDE5基因在mRNA水平和蛋白水平于转染后3d明显下调,5-7d PDE5-siRNA干扰效率达到峰值,10d后开始降低,但第14天干扰效率仍维持较高水平,与阳性对照组一差异无统计学意义(P>0.05)；腺病毒介导的iNOS基因于转染24h后在mRNA水平和蛋白水平出现显著上调,转染后5-7d达到峰值,10d后开始降低,14天后仍维持较高表达水平,其表达水平与阳性对照组二差异无统计学意义(P>0.05)；细胞内NO和cGMP浓度于转染3d后显著增加,5-7d达到峰值,于第10天出现明显降低后再次增加,至第14天仍维持较高浓度水平。结论PDE5-siRNA和iNOS基因在ADSCs中有效、稳定共表达,且能同时有效提高细胞内NO和cGMP浓度水平,从而为PDE5-siRNA和iNOS基因修饰的ADSCs移植治疗ED的体内研究提供了有力的工具。