论文部分内容阅读
目的:血管内皮功能严重影响着冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的发生及进展过程。血管内皮功能紊乱可导致动脉粥样硬化的发生、斑块进展以及冠心病并发症发生。Ephrin-B2是血管发生及血管内皮功能调控中的一个重要的调控因子。Ephrin-B2可通过调控受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员的功能来调控血管内皮细胞及其相关细胞的迁移，增殖，粘附，细胞间信号传递等生物过程。然而其对内皮细胞的功能及信号通路方面的研究仍未完善，且缺乏磷酸化蛋白质组学水平上的研究。本课题运用液-质联用色谱法从磷酸化蛋白质组学水平上探究人重组ephrin-B2/Fc蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内蛋白质磷酸化水平的影响，分析并揭示差异表达的磷酸化蛋白所参与的细胞和分子功能、毒性作用、信号通路、疾病和生物学功能、相互作用网络等。并在细胞水平上探究人重组ephrin-B2/Fc蛋白对人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、凋亡、自噬等功能及信号通路的影响，进一步验证磷酸化蛋白质组学相关结果。为探索ephrin-B2在血管内皮功能紊乱中的保护作用奠定基础，为冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗提供新的思路。 方法:从新生儿脐带中原代分离、培养人脐静脉内皮细胞。用稳定性同位素标记1ug/ml ephrin-B2/Fc蛋白处理组及对照组HUVECs，液-质联用色谱法检测ephrin-B2/Fc蛋白对HUVECs内蛋白质磷酸化水平的影响并用IPA平台对磷酸化蛋白质组学数据行生物信息学分析。用CCK8法检测不同浓度(0，0.1，0.3，1ug/ml)的ephrin-B2/Fc蛋白处理HUVECs1，3，5，7天对细胞增殖的影响;依据不同浓度（0.1，0.3，0.5，1mmol/l）的过氧化氢对HUVECs凋亡的影响，选取适宜的促凋亡浓度;检测不同浓度的ephrin-B2/Fc蛋白预处理2小时对过氧化氢诱导的HUVECs凋亡的保护作用。用细胞划痕实验检测不同浓度(0，0.1，0.3，1，3ug/ml)的ephrin-B2/Fc蛋白对HUVECs迁移的影响。用蛋白质免疫印迹实验检测ephrin-B2/Fc蛋白处理不同时间(5min，15min，30min，1h，2h)后HUVECs内增殖凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、caspase-3，迁移相关蛋白Twist、MMP9，自噬相关蛋白LC3B、P62，信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、eNOS、p-P38、P38的表达。 结果:磷酸化蛋白质组学研究表明，ephrin-B2/Fc蛋白处理后，HUVECs内差异表达的磷酸化蛋白与细胞生长和增殖，细胞死亡和存活，细胞迁移，血管生成，细胞凋亡等分子及生物学功能密切相关，且与整合素，Rho GTPase，ERK5，IGF-1，Rac，ERK/MAPK，VEGF，PI3K/AKT等信号通路密切相关。Ephrin-B2/Fc可促进HUVECs增殖，且其促增殖作用呈时间依赖性及浓度依赖性。过氧化氢可促进HUVECs凋亡，且其促凋亡作用呈浓度依赖性;1ug/ml的ephrin-B2/Fc可抑制过氧化氢引起的HUVECs凋亡。Ephrin-B2/Fc可促进HUVECs迁移，且其促迁移作用呈浓度依赖性。Ephrin-B2/Fc处理一定时间可增加HUVECs内抗凋亡蛋白Bcl-2，促迁移蛋白Twist、MMP9，信号通路蛋白pAkt、eNOS、pP38的表达，减少促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达，对促凋亡蛋白Bax、自噬底物P62的表达无明显影响。 结论:Ephrin-B2/Fc可上调入脐静脉内皮细胞内增殖、迁移相关蛋白的表达，下调入脐静脉内皮细胞内凋亡相关蛋白的表达，促进入脐静脉内皮细胞的增殖与迁移，激活PI3K/Akt/eNOS及P38信号通路，抑制过氧化氢引起的人脐静脉内皮细胞的凋亡，对人脐静脉内皮细胞自噬有着双向的调节作用，且对人脐静脉内皮细胞内蛋白质的磷酸化有着重要的影响。