胃癌是我国常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率都很高。ECF方案（表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶）是治疗胃癌的标准化疗方案之一。但是多药耐药（multidrug resistance, MDR）的出现,往往使胃癌化疗失败。顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药机制已经有很多的报道,但是关于胃癌表柔比星耐药相关分子目前还知之甚少。本实验室在建立了胃癌MDR细胞亚系的基础上,应用抑制消减杂交和差异显示PCR等基于基因型的筛选方法,成功筛选出了一些MDR相关基因。但是胃癌耐药的机制很复杂,应用这种基于基因型的筛选方法获得的基因仍然很难完全阐明耐药发生的机制,而且这些分子与耐药的发生是因果关系、果因关系或仅为伴随现象很难确定。简约化原则是生物体生物学功能完成过程中的统一原则,理论上耐药的发生不可能是大量的、无规则的细胞事件,而应是在一定规律调控下的有序过程,换言之,耐药发生的调控应是受数个关键分子调控的结果。因此,以功能为基础,采用基于表型的高通量筛选方法来获得耐药相关的重要基因,探索众多分子之间点与点、面与面、立体的网络调控作用,来阐明耐药发生的分子机制和调控网络就显得十分重要。双链小干扰RNA（siRNA）可以在多种类型的细胞中介导特异性的基因沉默作用,这一现象的发现为深入研究单个基因的功能提供了重要的方法学基础,从而得到了广泛的应用。最近的文献报道了全基因组siRNA文库的建立,为高通量基因功能分析和研究提供了新的方法,成为新的研究热点。siRNA文库可以用来筛选和研究介导复杂细胞表型和生物学过程的关键基因,通过建立一系列具有目的表型的细胞系,有可能对特定细胞信号调节通路进行更为全面的解析。因此,我们认为利用siRNA文库的筛选方法可以筛选出表达水平被特异siRNA下调后引起胃癌单药甚至是多药耐药的基因。siRNA文库为胃癌耐药的研究提供了新的手段,为全面理解肿瘤耐药的机制带来了新的契机。新的胃癌多药耐药基因的发现和研究,将为胃癌的治疗提供新的靶点。表柔比星是最常用的胃癌标准化治疗方案ECF的组成药物之一,对表柔比星耐药相关基因进行筛选和研究,相对来说更为贴近临床。本课题将对此进行探讨。【目的】1、构建部分随机siRNA逆转录病毒文库;2、在胃癌细胞系SGC7901中筛选胃癌表柔比星耐药相关基因;3、探讨候选靶基因在胃癌耐药中的作用及其可能的分子机制。【方法】1、利用分子克隆技术构建小干扰RNA逆转录病毒表达载体,采用Western Blot、MTT和荧光显微镜观察对其功能进行验证。2、按照文献报道的设计有效siRNA的法则,合成部分随机的siRNA库引物以及短片段的延伸引物,通过大规模的退火、第二链延伸、酶切、纯化、连接以及转化等步骤建立部分随机的siRNA质粒文库,并包装为逆转录病毒。3、将此病毒文库感染胃癌细胞SGC7901,加入表柔比星进行筛选。然后收集存活细胞,提取基因组DNA,通过PCR钓取功能siRNA分子,通过生物信息学分析获得胃癌耐药的相关基因。4、通过Realtime RT-PCR、Western Blot、MTT、流式细胞术等方法对候选基因进行功能验证,并探讨其介导胃癌耐药的可能机制。【结果】1、成功构建了siRNA逆转录病毒表达载体我们将逆转录病毒表达载体PBMN-Z和逆转录病毒嵌合表达载体PBMN-GFP分别双酶切后进行连接,构建出新的逆转录病毒表达载体pRetroGFP,使其不但具有逆转录病毒的表达元件,而且可以表达绿色荧光蛋白GFP,以便于后续的筛选和监测工作。同时,我们将促细胞周期进展分子Cdc2 siRNA的特异性寡核苷酸克隆到siRNA表达载体Phippy中,构建成pHippy-Cdc2,然后通PCR的方法扩增出Cdc2的序列和siRNA的表达图框,最后和pRetroGFP连接,构建成新的小干扰RNA逆转录表达载体psiRNA-Cdc2。因此,我们构建好的siRNA逆转录病毒表达载体来源于三个不同的载体:PBMN-Z、PBMN-GFP和Phippy。为了提高逆转录病毒的感染效率,我们将Ecotropic receptor转染SGC7901细胞,建立稳定转染的细胞系SGC7901-rec。然后,将psiRNA-lib-Cdc2和psiRNA-lib-cont分别转染包装细胞PhoenixTM Eco,包装为逆转录病毒。将病毒分别感染SGC7901-rec细胞,并分别命名为SGC7901/siCdc2和SGC7901/cont细胞系。接着我们验证了构建的siRNA逆转录病毒表达载体的有效性。病毒感染后48小时,我们利用Western blot检测了Cdc2分子的表达,结果提示,Cdc2在SGC7901/siCdc2中的表达较对照细胞SGC7901/cont显著下调。MTT实验也证实,SGC7901/siCdc2较对照细胞SGC7901/cont的生长速度明显减慢。感染后72小时对两种细胞进行荧光显微镜观察,根据绿色荧光蛋白GFP的表达情况,病毒的感染效率约为20%,同时,通过光学显微镜下的细胞计数发现,SGC7901/siCdc2较SGC7901/cont的细胞数目显著减少,增殖显著减慢。2、随机siRNA逆转录病毒文库的构建首先进行了小片段双链DNA的制备:按照文献报道的设计有效siRNA的法则,合成部分随机siRNA库引物和小片段延伸引物,并进行引物的退火。我们发现退火产物直接加入Klenow进行延伸,效率高于Qiagen Nucleotide removal kit纯化退货产物后再进行延伸。通过比较发现,Klenow和PCR的延伸效果类似,以PCR法略优,因此本研究将采用PCR法进行引物的延伸。库引物和延伸引物的摩尔比为1:10左右的时候延伸效率最高。检测发现50μl的PCR反应体系中,2μl的Taq酶较5μl的Taq酶的延伸效果好。PCR延伸后的DNA双链片段大小为55bp。经Sal ?和Cla ?酶切后的双链小片段即为目的小片段,由Qiagen Nucleotide removal kit纯化,该试剂盒的小片段回收效率为40%。质粒psiRNA-lib-Cdc2也进行Sal ?和Cla ?双酶切。为了防止双酶切后的大片段和原载体不易区分,我们将酶切产物和另外一个较大片段进行连接后再进行双酶切。Sal ?和Cla ?双酶切的产物经过定量为50ng/μl。载体和片段制备成功后,进行预连接。我们发现,当载体和片段的比例为1:10的时候连接效率最高,50ng的载体在10cm的平皿约转化出8×103个克隆,50ng的自连载体在10cm的平皿约转化出50个克隆。最后进行大规模的连接,总共连接500个10cm的平皿,构建了库容为4×106的随机siRNA质粒文库。文库的构建重复了8次。文库构建完毕后,我们随机挑取96个克隆,进行EcoR ?酶切鉴定,有效克隆数为91%。随机挑取20个克隆进行测序,除了一个克隆没有片段插入,一个克隆出现TTTTT的终止信号,其余18个克隆均正确的插入了序列唯一的siRNA片段,平均GC含量为41.1%。3、利用随机siRNA逆转录病毒文库筛选胃癌表柔比星耐药相关基因48μg的随机siRNA质粒文库转染包装细胞后包装为逆转录病毒,感染SGC7901-rec细胞,加入表柔比星进行筛选。感染后2周出现第一批耐表柔比星的存活克隆。文库的筛选共持续了8周。在整个筛选过程中,文库组和对照组完全平行操作。对照组筛选后没有存活克隆出现。以上的文库筛选过程共重复了8次。将文库组筛选后存活的细胞提取基因组DNA,利用siRNA表达框两端的引物序列进行PCR扩增,测序后,共获得12个siRNA分子。MTT检测显示这12条siRNA分子的转染都可以不同程度的降低SGC7901-rec细胞对表柔比星的敏感性,其中siRNA001和siRNA003最为显著。siRNA001转染细胞的IC50是对照细胞的4.3倍,而siRNA003转染细胞的IC50是对照细胞的3.9倍,提示siRNA001和siRNA003可能参与了胃癌细胞对表柔比星的耐药。经BlAST分析,siRNA001和siRNA003分别和人类GAS1基因（growth arrest-specific 1）和PTEN基因（phosphatase and tensin homolog）的靶mRNA序列有很高的同源性。而其它10个siRNA分子没有找到对应的靶基因。siRNA001的正义链（TTCATTTCCATGAAGCCACCG）和GAS1基因（NM₀02048.1） mRNA序列的204-224位点（TTCATTTCCAGGAAGCCACCG）有95%的同源性,其中有一个碱基不匹配（11位为T,而不是G）。siRNA003的正义链（TTTAACTGTATTATTTGGCAG）和PTEN基因（NM₀00314.4） mRNA序列的5221-5241位点（TTTAACTGTAGTATTTGGCAG）有95%的同源性,其中有一个碱基不匹配（11位为T,而不是G）。Real-time RT-PCR和western blot的检测证实, GAS1在SGC7901/siGAS1（转染了完全匹配的GAS1 siRNA）和SGC7901/ siGAS1 （+）（转染了有一个碱基突变的GAS1 siRNA）细胞系中的表达显著下调,较对照细胞系SGC7901/cont降低80%以上。提示我们筛选出来的有一个碱基突变的siRNA分子可以和完全匹配的siRNA分子一样可以显著的抑制细胞中GAS1的表达。MTT实验证实下调GAS1的表达可以显著降低SGC7901细胞对表柔比星的敏感性。PTEN的研究结果和GAS1相似。4、GAS1的表达下调促进胃癌多药耐药的发生我们利用Western Blot检测了不同胃癌细胞系（SGC7901、MKN45、AGS和MKN28）中GAS1的表达,结果发现GAS1在AGS和MKN28细胞系中的表达较低,因此我们选取这两种细胞来上调GAS1的表达。结果发现:在化疗药物（表柔比星+5-氟尿嘧啶+顺铂）作用的情况下,上调GAS1的表达可以促进胃癌细胞的进一步死亡。在化疗药物（表柔比星+5-氟尿嘧啶+顺铂）存在的情况下,下调四种胃癌细胞中GAS1的表达,可以显著促进细胞的存活。但是,在GAS1表达较低的AGS细胞中,这一作用不明显,提示这一作用是和细胞内GAS1的表达水平直接相关的。我们同时检测了GAS1在胃癌细胞系SGC7901和其耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达。结果发现GAS1在耐药细胞系中的表达显著下调。上调GAS1的表达可以增加两种耐药细胞对表柔比星的敏感性。我们探讨了GAS1下调促进胃癌细胞耐药的分子机制。一方面,下调GAS1的表达可以部分通过上调Bcl-2/Bax,抑制凋亡而促进耐药的发生,而这一耐药表型可以部分的被Bcl-2的特异siRNA表达载体转染所逆转。另一方面,下调GAS1的表达可以部分通过上调ABC转运体超家族的成员P-gp和BCRP（而不是MRP-1）,来促进药物的外排,进而促进耐药的发生。同样,这一耐药的表型可以部分的被P-gp和BCRP的特异siRNA表达载体所逆转。在下调GAS1表达的胃癌细胞中,P-gp的抑制剂维拉帕米可以部分逆转P-gp的底物药物（表柔比星）介导的耐药,而对非P-gp底物的药物（5-氟尿嘧啶和顺铂）介导的药物没有逆转作用。我们还发现,在GAS1下调的胃癌细胞中,BCRP的特异siRNA表达载体可以部分的逆转5-氟尿嘧啶介导的耐药,而对顺铂介导的耐药没有显著影响,提示5-氟尿嘧啶可能是BCRP的底物。另外,MTT检测发现下调GAS1的表达可以促进胃癌细胞的增殖,提示促进细胞增殖可能也是GAS1下调介导耐药发生的可能机制之一。【结论】我们首次构建了一个部分随机的siRNA逆转录病毒文库,并利用这一高通量筛选技术,对胃癌表柔比星耐药相关基因进行了表型为基础的功能筛选。通过筛选,我们发现了一个新的胃癌表柔比星耐药相关基因GAS1,GAS1基因的表达下调可以促进胃癌细胞对表柔比星的耐药,甚至是多药耐药（具体一点）。我们同时对其介导耐药的可能机制进行了探讨（具体一点）。该文库为胃癌耐药的研究提供了新的手段,为全面理解肿瘤耐药的机制带来了新的契机。新的胃癌多药耐药基因GAS1的发现和研究,将为胃癌的治疗提供新的靶点。