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结核(TB)是由结核分支杆菌(M.tb)引起的感染性疾病,在发展中国家仍然有很高的发病率和死亡率。伴随我国人民生活水平的提高,二型糖尿病(T2DM)的发生逐年攀升,因其代谢紊乱所引发的氧化还原失衡和免疫功能低下致使T2DM患者成为结核病的超危易感人群。常规的抗结核病治疗的标准化疗法需持续半年至九个月的长时间服用多种抗生素,对于一些肝功能受损或共感染其他疾病的患者如糖尿病,抗生素的肝毒副作用和药物相互作用给结核病本身的治疗带来了巨大的挑战。N-乙酰半胱氨酸(NAC),作为细胞内谷胱甘肽(GSH)合成的前体,已被证实具有抗氧化作用,可以通过改善免疫细胞内谷胱甘肽(GSH)的水平,调节促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的释放,从而提高免疫细胞对抗结核杆菌感染的能力。因此N-乙酰半胱氨酸(NAC)联合低剂量的一线抗结核药物为结核病的治疗提供了新思路。目前用于体外研究结核药物的模型大多为单一种免疫细胞、细胞系或动物模型,不能完全模拟人类疾病的复杂机制,体外肉芽肿模型的建立可以系统地研究宿主抗结核杆菌免疫应答的机制。抽取8例健康人和5例二型糖尿病(T2DM)患者外周血40 ml,密度梯度离心法抽提外周血单个核细胞(PBMCs),血浆留存备用。用毒性结核杆菌菌株Erdman以感染复数(MOI)0.1:1感染PBMCs,24孔细胞培养板每孔分别加入6×105个细胞和500μl含人AB血清的RPMI培养基,不同处理组加入最小抑菌浓度(MIC)的单一种抗生素异烟肼(INH),利福平(RIF),和乙胺丁醇(EMB)含或不含10 m M的N-乙酰半胱氨酸(NAC),空白对照组不加药物,培养数天形成肉芽肿。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定感染后第15天(终止培养点)细胞培养上清中及健康人与二型糖尿病(T2DM)患者血浆中IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-12和IL-10的含量。利用反复冻融法裂解细胞,裂解的细胞溶液涂布于7H11琼脂固体培养基,采用细菌集落实验计算E rdman菌在肉芽肿内的存活率,分光光度比色法测定余下的细胞裂解液中谷胱甘肽(G SH)的水平。快速苏木精-伊红(H.E.)染色法鉴定第15天不同组肉芽肿的形态大小,荧光显微镜统计溶酶体红色荧光探针标记的肉芽肿与绿色荧光蛋白标记的Erdman吞噬溶酶体形成数量。从而探究不同处理组肉芽肿对细胞因子的释放,胞内谷胱甘肽(GSH)水平,肉芽肿形成的大小、数量,吞噬溶酶体融合数量与Erdman菌在肉芽肿中存活率的相关性,并比较健康人与二型糖尿病(T2DM)患者血浆中细胞因子含量与谷胱甘肽(GSH)水平的差异,及这种差异与两类人群体外肉芽肿结构抗结核杆菌感染能力差异的相关性。结果如下:1.T2DM患者血浆中TNF-α,IL-6,IFN-γ的水平均显著低于健康人(P<0.05),I L-12也有一定水平下降,差异不显著,且这些细胞因子与红细胞中的谷胱甘肽(GS H)水平呈正相关,与自由基的清除能力呈负相关。2.抗生素处理组,无论是在二型糖尿病(T2DM)患者还是健康人对照组,均对肉芽肿内结核杆菌的存活有显著清除作用,联合使用N-乙酰半胱氨酸(NAC),在健康人组中可以完全清除,但在二型糖尿病(T2DM)组仍有少量存活,但与相应只用抗生素处理的组相比有显著下降。3.肉芽肿对结核杆菌的清除能力与IL-6,IL-12,IFN-γ的释放水平有关,N-乙酰半胱氨酸对它们的释放有一定促进作用。根据H.E.染色结果显示,N-乙酰半胱氨酸对肉芽肿形态大小、结构状态的的维持有积极作用,含N-乙酰半胱氨酸的组有较为巨大坚固的肉芽肿结构。我们猜测肉芽肿清除结核杆菌的机制是由于IL-12,IL-6浓度上调从而激活巨噬细胞并促进吞噬-溶酶体融合引起,溶酶体红色荧光探针法进一步证实了这一机制,N-乙酰半胱甘酸共用组与单独使用抗生素组比较,有更多在酸化部分的细菌和非酸化部分相比。有趣的是,TNF-α,一种在肉芽肿结构维持中起重要的作用的细胞因子,在N-乙酰半胱氨酸处理后有一定程度的下降,这很可能是由于肉芽肿结构已经形成,对TNF-α的需要不再那么强烈,其浓度总是维持一定量,因为过多的TNF-α还会引发氧化应激反应而不利于结核杆菌的清除。综上,肉芽肿是体外研究免疫系统抗结核杆菌感染的良好模型;N-乙酰半胱氨酸(NAC)在结核杆菌清除与机体免疫功能的调节中起到了重要的作用,可以作为有效的治疗结核的辅助药物;N-乙酰半胱氨酸(NAC)与一线抗结核药物在肉芽肿抗结核杆菌感染的免疫应答中有协同作用。