猪瘟（classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪的高度传染性疾病,给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗接种仍是CSF的主要防控手段,然而猪瘟兔化弱毒疫苗缺乏合适的免疫学标记物,无法在血清学上区分感染和免疫动物（Differentiating infected from vaccinted animals,DIVA）,给我国CSF净化和防控带来巨大的困难。CSFV E2蛋白是CSFV的主要抗原蛋白,是猪瘟亚单位疫苗研制的理想候选蛋白。但由于猪瘟E2亚单位疫苗抗原单一,在实际使用中并不能达到理想效果,故本研究尝试改造E2蛋白,以期提高猪瘟E2亚单位疫苗免疫效果。本研究于CSFV C株的E2基因中引入CSFV线性抗原表位基因,设计出了CSFV抗原表位/E2融合蛋白（r E2）,以期能提高E2蛋白的免疫原性。根据杆状病毒载体表达系统（Baculovirus Expression Vector System,BEVS）的密码子优化原则,优化r E2基因序列,人工合成r E2基因。将杆状病毒gp67信号肽基因和r E2基因克隆至转移载体p Fast Bac Dual,获得重组转移载体p FBD-gp67sg-r E2;同时将杆状病毒gp67信号肽基因和CSFV E2基因克隆到转移载体p Fast Bac Dual中,获得重组转移载体p FBD-gp67sg-E2。将重组转移载体p FBD-gp67sg-r E2和p FBD-gp67sg-E2分别转化至含有杆状病毒基因组质粒（Bacmid）的DH10Bac感受态细胞,经细菌内的转座作用,获得重组杆状病毒基因组质粒r Bac-gp67sg-r E2和r Bac-gp67sg-E2。将r Bac-gp67sg-r E2和r Bac-gp67sg-E2分别转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-gp67sg-r E2和Ac-gp67sg-E2;将重组病毒Ac-gp67sg-r E2和Ac-gp67sg-E2分别感染Sf9细胞,感染后72 h,通过蛋白免疫印迹试验（Western blot,WB）和间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）检测感染细胞中融合蛋白r E2的表达情况。Western blot结果显示,感染Ac-gp67sg-r E2的细胞样品在60 k Da处有特异性条带,感染Ac-gp67sg-E2的细胞样品在55 k Da处有特异性条带;IFA结果显示,感染Ac-gp67sg-r E2的细胞和感染Ac-gp67sg-E2的细胞均能在荧光显微镜下观察到特异性荧光。结果表明,重组杆状病毒Ac-gp67sg-r E2和Ac-gp67sg-E2构建成功,表达的r E2融合蛋白和E2蛋白具有良好的反应原性。将重组杆状病毒Ac-gp67sg-r E2分别以MOI为0.1、0.5、1、2的剂量感染High Five细胞,用Western blot半定量方法分别检测感染后48 h、72 h、96 h、120 h的细胞培养物中r E2融合蛋白的浓度。结果显示,在感染后48 h,不同剂量的重组病毒感染的细胞培养物中均能检测到r E2融合蛋白的表达;当MOI为2时,感染后120 h的细胞培养物中r E2融合蛋白浓度可达320μg/m L。结果表明,引入了亲水性线性抗原表位和gp67信号肽的r E2融合蛋白能在High Five细胞中高效表达。本研究表达的r E2融合蛋白和E2蛋白分别与ISA 201VG佐剂混合制备成猪瘟亚单位疫苗,分别免疫2月龄仔猪。免疫分组如下:组1为r E2融合蛋白免疫组;组2为E2蛋白免疫组;组3为PBS空白对照组。首次免疫后第21 d以相同剂量进行加强免疫,用ELISA试剂盒检测首次免疫后第7、14、21、28和35 d实验猪血清中CSFV E2特异性抗体水平;在首次免疫后第35 d,以105 TCID50 CSFV石门株对实验猪进行攻毒,观察并记录攻毒后实验猪的临床体征,攻毒后第15 d对存活猪进行剖检。抗体检测结果显示,r E2融合蛋白和E2蛋白均可在加强免疫后诱导机体产生高水平CSFV E2特异性抗体。攻毒试验结果显示,组1和组2的猪在攻毒后体温略微升高,其中组2体温升高持续时间更长;对组1和组2的猪剖检发现,组1个别猪和组2所有猪的部分组织器官出现了轻微病理变化;组1和组2的猪在攻毒后14 d内全部存活,组3的猪攻毒后全部发病死亡。结果表明,本研究设计和表达的r E2融合蛋白具有优良的免疫原性。综上所述,本研究设计的r E2融合蛋白能在High Five细胞中高效表达并具有优良的免疫原性,为新型猪瘟亚单位疫苗的研制提供了参考。