论文部分内容阅读
鸡马立克病（Marek’s disease,MD）是由鸡马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的一种鸡上最常见的T淋巴细胞增生性疾病。疫苗免疫是防控MD的主要措施。目前,我国使用最广泛的是CVI988/Rispens疫苗。然而近年来,有的鸡群免疫CVI988/Rispens疫苗后仍有马立克病的发生,影响了我国养禽业的健康发展,造成经济损失。禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是一种可以引起多种肿瘤性疾病的免疫抑制性病原,它主要通过垂直感染的方式进行传播。流行病学调查显示,MDV感染鸡群常伴发ALV等免疫抑制性病原的共感染,ALV的先天感染有可能是造成免疫CVI988/Rispens疫苗鸡群仍发生MD的原因之一。为证实这一推论,本文通过动物试验人工模拟先天感染J亚群禽白血病病毒（ALV-J）探究对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响。此外,针对本实验室研发的新型MD疫苗SC9-1株与市场其他疫苗株尚无特异性鉴别方法的问题,建立了区别SC9-1株与其他株MD疫苗的分子鉴别方法。1.先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响为研究先天感染ALV-J对CVI988/Rispens疫苗免疫保护效果的影响,将200枚SPF鸡胚分为5组,每组40枚。第1、2组为先天感染ALV-J组,在6胚龄时通过卵黄囊途径接种500 TCID500 ALV-J NX0101株。出壳后,第1、2、3、5组鸡颈部皮下免疫CVI988/Rispens疫苗,6日龄对第2、3、4组鸡均以2000 PFU/只的剂量腹腔注射MDV超强毒GX0101。试验期间,观察并记录各组鸡的病变及死亡情况,统计死亡率和肿瘤发生率,对疑似马立克病特有的病变脏器做病理切片;MDV GX0101攻毒后第1、2、3、4、5、6周称量各组鸡的体重;所有鸡10日龄免疫禽流感、新城疫灭活苗,免疫后第3、4、5周检测相应抗体水平;在GX0101攻毒后第1周每组随机选取5只鸡进行剖检,选取胸腺和法氏囊测定免疫器官指数;第2、3、4组在GX0101攻毒后5、10、14、21、28天,每组各随机选取6只鸡采集抗凝血分离淋巴细胞提取DNA,利用荧光定量PCR方法检测GX0101的拷贝数。研究结果表明,先天感染ALV-J增加了CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡的死亡率和肿瘤率,2组死亡鸡中一只鸡肝脏出现肿瘤,1、2、3、4、5各组鸡的死亡率分别为:5.7%、20%、2.9%、37.1%、0%;先天感染ALV-J、CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡的体重与CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡相比,体重显著降低（P<0.05）,引起胸腺和法氏囊的萎缩,显著抑制AIV-H9、NDV抗体的产生,GX0101的拷贝数在第14、21、28天显著高于CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组。因此,先天感染ALV-J降低了CVI988/Rispens疫苗的免疫保护效果,引起感染鸡的免疫抑制,增强了GX0101在鸡体内的复制水平以及致病性,这或许表明先天感染ALV是造成免疫CVI988/Rispens疫苗后鸡群仍发生MD的原因之一。2.不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立为了对马立克病病毒meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT Fc-126株进行分子鉴别,根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDV meq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列（REV-LTR）插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1297bp、1297bp目的片段,HVT Fc-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT Fc-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT Fc-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行核酸斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT Fc-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行核酸斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT Fc-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法可以有效区分SC9-1与市场其他MD疫苗株。