植物固有的或者可诱导的产生化感物质来防御植食性昆虫。成功的植食性昆虫能够依赖自身的能力反防御或者适应植物的这种防御物质并且这种进化上的军备竞赛被认为是形成了植物和植食性昆虫的协同进化。十字花科植物（Cruciferae）含有硫苷-黑芥子酶防御系统,这是目前研究比较透彻的一种植物化学防御系统,也被称作“芥子油炸弹”。硫苷和黑芥子酶分开储存在不同的植物细胞中,当植物受到昆虫取食,病原微生物侵害、机械损伤等危害时,植物体内的黑芥子酶被激活与硫苷结合,催化其产生有毒的水解产物—异硫氰酸酯（isothiocyanate,ITC）、腈类化合物（nitrile）和其它活性物质等,从而避免或者减少植物受到损害。然而在长期的协同进化过程中,十字花科蔬菜害虫也具有了相应的反防御系统才能够适应寄主。这种反防御系统根据硫苷种类的不同,也具有多样性,且不仅表现在十字花科广食性和寡食性昆虫之间,还表现在广食性和寡食性昆虫之内。十字花科寡食性昆虫,小菜蛾Plutella xylostella（L.）,能够利用自身含有的硫苷硫酸酯酶GSSs（PxylSulf2和PxylSulf3）使寄主植物硫苷快速脱硫,从而使得黑芥子酶无法识别和水解底物,而硫酸酯酶的活性需要其修饰因子（SUMF1）在翻译后对其一个半胱氨酸进行修饰。因此,本论文利用生物信息学技术比较了不同昆虫的硫酸酯酶及其修饰因子,并且从体内和体外系统结合以及功能验证等多个角度综合研究了小菜蛾的硫酸酯酶及其修饰因子,以期为研究十字花科蔬菜害虫与寄主植物协同进化提供借鉴和参考。主要的研究结果如下:1.小菜蛾（P.xylostella）硫酸酯酶和硫酸酯酶修饰因子基因家族的表达模式和功能我们从小菜蛾中共鉴定出12个硫酸酯酶（PxylSulfs）和2个硫酸酯酶修饰因子（PxylSumf1s）。小菜蛾,与家蚕Bombyx mori,烟草天蛾Manduca sexta,诗神袖蝶Heliconius melpomene,帝王斑蝶Danaus plexippus,黑腹果蝇Drosophila melanogaster,二斑叶螨Tetranychus urticae以及智人Homo sapiens的硫酸酯酶构建进化树分析发现,节肢动物硫酸酯酶聚类成五个明显的分支,而其修饰因子分为两组。表达谱和实时荧光定量发现两个硫代葡萄糖苷基因（GSSs）,PxylSut2和PxylSulf3主要是在小菜蛾3龄和4龄幼虫中肠表达。并且,PxylSulf2,PxylSulf3和PxylSut4与其修饰因子PxylSumf1a的表达具有相关性。利用小干扰RNA下调萝卜苗饲养的3龄幼虫PxylSulf2,PxylSulf3和PxylSumf1a的表达,然而在取食萝卜苗后,结果分别造成72 h后44-59%的死亡率和成虫羽化后87-90%的死亡率,而相比对照处理分别为10.6%和34%。随后,利用CRISPR/Cas9技术编辑了小菜蛾PxylSulf2基因的核心序列,并在G0代获得了 50%以上的突变个体。这些突变体分别与野生型杂交后的F1代个体中,不仅找到了与G0代相同的突变类型,还找到了 2种以上与G0代母体不同的突变类型,这为我们获得小菜蛾PxylSulf2基因的纯合突变体提供了多样性。本研究的这些发现为从基因表达、基因结构和功能等方面研究小菜蛾PxylSumf1和PxylSulfs基因提供了新的思路,并且这些基因也可被认为是小菜蛾进化成为重要的十字花科寡食性害虫的关键因素。2.寄主植物硫苷对寡食性和广食性昆虫SULFs和SUMF1基因表达的影响比较研究了寡食性昆虫小菜蛾和广食性昆虫粉纹夜蛾在不同十字花科寄主植物、同一十字花科拟南芥植物不同硫苷种类突变体上的取食偏好,包括人工饲料,花椰菜,拟南芥以及同一背景下的的黑芥子酶突变体Tgg1/2,脂肪型硫苷突变体Myb28/29,吲哚型硫苷突变体Cyp79B2/B3,以及这两种类型硫苷的双突变体Cyp79B2/B3Myb28/29。同时比较了这两种昆虫在取食这些植物后其SULFs和SUMF1的基因表达模式。两次实验,都表明寡食性昆虫小菜蛾在人工饲料上体重增加最多,且一直生长在同一食物源的小菜蛾比在4龄初期转到植物上体重增加的多。广食性昆虫粉纹夜蛾在花椰菜上体重增加最多,且与小菜蛾相似,一直生长在同一食物源的粉纹夜蛾比在5龄初期转到植物上体重增加的多。这种结果可能是,昆虫取食后诱导的植物防御反应造成的。其次,两次实验结果都表明,无论是在同一食物源从初孵幼虫长到4龄的小菜蛾,还是从4龄初转到拟南芥植物上的小菜蛾,其PxylGSS1的表达与植物硫苷都有一定的响应关系,尤其是在花椰菜上,显著诱导表达。与取食不同硫苷植物后的PxylGSS1表达模式显著不同的是,PxylGSS2表达主要响应拟南芥植物,对硫苷含量较高的花椰菜反而没有显著的响应表达。与两个PxylGSSs基因的表达模式不同,PxylSumf1都是在4龄从人工饲料转植物后基因表达有一定倍数的显著诱导,而在同一食物源从初孵幼虫长到4龄的小菜蛾PxylSumf1其表达量不受植物不同硫苷变化的影响。广食性昆虫粉纹夜蛾的两次重复实验都表明,无论是一直生长在同一食物源,还是在5龄初期转到植物上,在取食花椰菜后TniSulf1的表达显著升高,同时我们发现TniSulf1的这种诱导表达与其幼虫在花椰菜上体重增加最多存在一定的相关性。粉纹夜蛾在5龄初期转植物后TniSulf2的表达在几种植物上都有显著升高,主要还是在花椰菜和野生型拟南芥上显著升,然而一直生长在同一食物源的粉纹夜蛾TniSulf2的表达在两次实验中都没有显著变化。比TniSulfl表达模式变化显著的一点是,TniSulf2的表达不仅在花椰菜上有诱导响应,在野生型拟南芥上也显著升高。总体而言,粉纹夜蛾TniSumf1的表达无论是在一直生长在同一食物源,还是在5龄初期转植物其表达都没有数据统计意义的显著升高,但是和TniSulf2的表达模式相似,在5龄初期转吲哚型硫苷突变体8 h后TniSumf1的表达升高。本研究比较了广食性和寡食性昆虫响应寄主植物硫苷的基因表达模式,旨在从不同食性的角度寻找昆虫与植物互作平行进化规律,这些发现为从植物硫苷含量及种类和小菜蛾解毒硫苷基因表达之间是否存在直接联系提供了新的进展。3.小菜蛾细胞系表达中肠基因PxylGSSs和PxylSumfl我们从小菜蛾Plutella xylostella的胚胎组织中共建立出六个细胞系,原代组织培养在含有10%牛血清的Grace昆虫培养基中,这些培养瓶放在27℃的人工气候箱中。目前,这些细胞系已经在实验室传代超过100次。这些细胞系主要分为三种形态:纺锤状细胞、上皮样细胞和圆形细胞;五种细胞贴壁生长,而FAFU&CU-Px-6细胞系悬浮生长。生长曲线测试结果显示这些细胞系的种群倍增时间范围为18到23 h。对线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（coI）基因序列分析发现,这些新建立的小菜蛾细胞系（FAFU&CU-Px-1-6）来自于本实验室的小菜蛾品系。在小菜蛾细胞中还检测了两个在小菜蛾中肠中共表达的基因,硫代葡萄糖苷硫酸酯酶（PxylGSSs）和硫酸酯酶修饰因子一的表达。已有研究表明PxylGSSs在小菜蛾解毒植物硫代葡萄糖苷过程中其重要作用。因此,本研究建立的小菜蛾细胞系（FAFU&CU-Px-1-6）在复杂的硫苷分子解毒机制以及昆虫与植物互作的研究方面,可能是有利的体外研究体系。