背景及目的:癌症是威胁人类健康的重大杀手之一,癌症的发生发展与原癌基因如表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)等基因的突变和异常表达等密切相关。EGFR是酪氨酸激酶I型受体亚家族的一员。靠与配体结合而活化,活化的EGFR将外界信号刺激传递到胞内,激活下游相关信号通路,参与细胞的生长、增殖、分化和凋亡调节。由于EGFR信号转导途径在细胞的增殖、损伤修复、细胞凋亡调节及新生血管形成等方面起重要作用,EGFR基因的异常高表达或突变,将不可逆转的导致细胞癌变。近年来靶向抑制EGFR已成为肿瘤治疗研究中的热点之一,并在临床应用中取得了显著的成果。但是耐药性问题也日益突出。为了提高EGFR突变肿瘤治疗效果并克服或降低肿瘤的耐药性,我们需要探索新的EGFR突变肿瘤的治疗策略。芹菜素(Apigenin)是天然黄酮类化合物中的一种,是初步探明的我国中草药中诸多的有效活性成分之一。在肿瘤抑制及治疗方面,我们及其他科学工作者的研究表明,芹菜素对包括肺癌,肝癌,乳腺癌等多种肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,并且对于EGFR下游相关信号通路中分子也具有抑制作用。这提示我们,芹菜素是有希望成为治疗含有EGFR突变肿瘤的潜在药物。前期实验结果显示芹菜素单药对EGFR突变肿瘤的治疗作用有限,通过药物筛选的方法我们发现ABT-263与芹菜素联合用药有较好的抑制EGFR突变肿瘤的作用。本研究的开展,揭示了以芹菜素为代表的黄酮类化合物内在的抗肿瘤机制,同时为含EGFR基因突变的肿瘤提供新的靶向治疗策略。方法及结果:一.芹菜素单药对EGFR突变肿瘤细胞的作用研究1.采用MTT方法分析含有不同EGFR突变细胞在用芹菜素单药处理后的存活率。结果显示,芹菜素对EGFR突变肿瘤细胞有抑制生长的作用但作用有限。2.克隆形成实验显示,芹菜素部分抑制了肿瘤细胞克隆集落的生长。二.ABT-263增强芹菜素在EGFR突变的肿瘤细胞中的抗肿瘤作用研究1.药物筛选寻找与芹菜素具有协同抗EGFR突变肿瘤细胞的药物。2.采用MTT的方法证明双药联合对于EGFR突变肿瘤细胞的生长抑制是具有时间及剂量依赖效应,且二者联合在EGFR突变肿瘤细胞的效果要优于EGFR野生型细胞,而对肺动脉平滑肌细胞PASMC毒副作用小。3.克隆形成实验结果证明双药联合能够抑制肿瘤细胞克隆集落的生长。4.免疫印迹实验证实联合用药导致细胞凋亡,而利用sh-RNA敲低Bax显著降低了由Apg与ABT-263联合所导致的细胞凋亡,说明二者引起了内源性(线粒体途径)凋亡。三.ABT-263增强芹菜素在EGFR突变的小鼠原B细胞(BaF3)细胞中的作用研究1.对所构建的含有EGFR突变的质粒分别进行单双酶切以及PCR鉴定,结果显示质粒构建成功。免疫印迹实验结果显示,含有EGFR突变的BaF3工程细胞系构建成功。2.MTT的结果显示在芹菜素单药效果有限的情况下,与ABT-263的联合能够显著抑制细胞的增殖。四.双药联合在AZD9291耐药性的H1975细胞株(H1975-AR)中的作用研究1.构建H1975的AZD9291耐药性细胞株。2.分别用一系列浓度梯度的AZD9291处理H1975以及H1975-AR并采用MTT以及克隆形成实验的方法,结果显示,AZD9291对H1975的细胞及集落的生长抑制作用相比于H1975-AR更为显著,从而证实H1975-AR构建成功。3.MTT以及克隆形成实验结果表明,芹菜素与ABT-263的联合能够抑制H1975-AR细胞的生长增殖。五.双药联合诱导凋亡作用机理研究1.免疫印迹实验显示芹菜素上调了凋亡相关蛋白Noxa表达,且对Noxa的调控是具有时间依赖效应的。2.通过基因敲减实验抑制Noxa的表达,MTT以及免疫印迹实验表明,抑制Noxa的表达能够显著降低由于双药联合导致的含有EGFR突变细胞的凋亡。3.环己酰亚胺处理细胞后免疫印迹实验以及实时荧光定量PCR实验表明,芹菜素对于Noxa的调控是发生在转录水平上的。4.利用免疫印迹检测EGFR下游信号通路相关蛋白分子,结果显示芹菜素能够抑制AKT以及ERK的磷酸化激活且芹菜素对二者的调控是具有时间依赖效应的。5.利用小分子抑制剂特异性抑制AKT或ERK,MTT以及免疫印迹检测结果显示,抑制AKT或ERK能够显著增强ABT-263所导致的凋亡。过表达AKT则能够部分拯救由于芹菜素和ABT-263联合用药所导致的细胞凋亡。6.通过分别抑制AKT以及ERK,免疫印迹实验以及实时荧光定量PCR检测Noxa,结果显示,Noxa为AKT的下游效应分子。7.抑制AKT将导致Fox03a磷酸化降低,显示Fox03a为AKT的下游分子。8.免疫印迹实验以及免疫荧光实验进一步证明芹菜素通过抑制Fox03a的磷酸化抑制其核转位而使其滞留在核中。sh-RNA实验显示,抑制FoxO3a的表达能够拯救由于芹菜素所导致的Noxa上调。六.双药联合在体内抗肿瘤作用研究1.体内实验证明,与对照组以及单药处理组相比,联合用药能显著地抑制小鼠肿瘤生长。2.免疫印迹检测结果表明.:与体外生化实验结果一致,芹菜素抑制了 AKT及其下游分子Fox03a的磷酸化,从而增强Noxa的表达,进而增强ABT-263所诱导的凋亡。结论及意义:前期实验结果显示芹菜素单药对EGFR突变肿瘤的治疗作用有限,药物筛选结果显示ABT-263与芹菜素的联合有较好的抑制EGFR突变肿瘤的作用。体内外实验表明,ABT-263与芹菜素的联合能够抑制EGFR突变肿瘤细胞的生长、促进凋亡。分子机制研究揭示芹菜素通过抑制AKT-Fox03a信号级联从而上调Noxa的表达,进而协同增强靶向药物ABT-263的抗肿瘤作用。体内结果与体外结果一致。本研究的开展,揭示了以芹菜素为代表的黄酮类化合物内在的抗肿瘤机制,同时为含EGFR基因突变的肿瘤提供新的靶向治疗策略。