长期以来，人们一直都认为任何方式的缺血都会对心肌造成伤害，即使是那些持续时间很短的缺血打击，也潜在着极大的危险。但Murry等却发现，间断的多次可逆性心肌缺血不会发生累加而造成严重的危害，并提出“缺血预处理”（Ischemic Preconditioning，IPC）的概念，即预先对心肌进行非伤害性的短暂的缺血处理，可使心肌获得对随后长时间持续缺血的耐受性。心肌缺血是围术期一种常见的病理学过程，尤其在心脏外科手术患者和实施非心脏手术的冠心病患者中往往更为多见。安全、可靠的心肌保护措施对提高麻醉质量和保证手术病人的围术期安全有非常重要的意义。因此IPC的概念一经提出即引起人们的极大兴趣，随着研究的不断深入，缺血预处理已被证实具有广泛的生物学效应：①减轻缺血／再灌注后心肌坏死的程度；②减少缺血／再灌注后恶性心律失常的发生；③促进缺血／再灌注后心脏功能的恢复；④改善缺血／再灌注后心肌的能量代谢。目前，不仅在各种实验动物和人类学研究中都已观察到这种保护效应的存在，而且还有资料显示它是当今最为有效的心肌保护措施。除了缺血，各种刺激包括：热应激、快速心室起搏及体力运动，多种药物包括：内毒素、白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF-a）、腺苷受体激动剂、阿片受体激动剂等均可诱导出类似IPC的保护作用。这种保护作用有两个明显的时相，第一时相发生在预处理后1～2h，第二时相发生在24～72h。前者被称为早期预处理（early preconditioning，EPC），后者被称为迟发预处理（delayed preconditioning，delayed PC）或预处理的第二窗口（The second window of preconditioning，SWOP）。目前普遍认为，IP实际上诱导了一个对缺血再灌注损伤起保护的双相性作用，即早期强大但是短暂的保护作用和晚期较弱但较持久的保护作用。IP的迟发保护作用比早期保护作用相对较弱，但是持续的时间要长得多，可持续24h-72h，因而更具临床意义。延迟预处理是在各种应激性刺激下心脏一系列细胞内事件级联反应的结果。可将此过程的各种作用因素分为二类：触发因子（Ifigger）在预处理的早期产生，对于延迟相预处理起初始化作用（initiator）；介导因子（mediator）在刺激后24-72h产生，是产生预处理延迟相保护作用的效应因子（effector）。信号传导通路由触发因子所激活，并直接导致介导因子的表达。各种触发因子通过激活细胞内复杂的信号传导级联事件最终导致心脏保护性基因转录增加，心脏保护性蛋白表达合成增多，而产生延迟预处理保护效应。其中蛋白激酶c（PKC）、蛋白酪氨酸激酶（PTK）、丝裂素激活蛋白激酶（MAPK）可能是延迟预处理传导通路的重要途径。MAPKs是一类广泛存在于真核细胞中的丝／苏氨酸蛋白激酶，包括3个主要的家族：p44／p42 MAPK（细胞外信号调节激酶，ERK），p38 MAPK及p46／p54MAPK（JNK）。有研究发现延迟预处理可激活上述3个MAPK亚家族，其中p38MAPK在缺血预处理信号传导过程中起一定作用，但在延迟预处理中的具体机制仍不十分清楚。已有研究表明，吗啡、芬太尼等阿片样物质均可诱导出相似的心肌保护作用。小剂量的脂多糖同样可以对随后的缺血再灌注损伤产生保护作用。本研究通过建立大鼠在体心肌的缺血／再灌注损伤模型，观察芬太尼和脂多糖作为触发因子、介导因子所产生的DPC保护作用的异同，观测血流动力学参数变化，心肌梗死面积，心肌细胞凋亡，p38 MAPK的表达，探讨这种保护机制及MAPK在其中的作用。实验材料一、实验动物：健康SD大鼠，雌雄不限，体重250-350克，由中国医科大学实验动物中心提供。二、主要试剂：3％戊巴比妥钠溶液：上海化学试剂采购站，用生理盐水自配伊文氏蓝（Evans blue，上海化学试剂采购供应站）2，3，5，三苯基氯化四氮唑（TTC）：上海国药集团化学试剂有限公司脂多糖（LPS）：美国Sigma公司纳洛酮：湖北宜昌人福药业有限公司出品芬太尼：湖北宜昌人福药业有限公司出品TUNEL试剂盒：购自武汉博士德公司Caspase-3试剂盒：江苏碧云天生物公司细胞色素C一抗：New Marker鼠抗p38 MAPK单克隆抗体和鼠抗phospho p38 MAPK单克隆抗体：江苏碧云天生物公司Western blotting二抗：Santa公司硝酸纤维素膜：Millitore公司三、仪器设备无菌用品及高压消毒小动物手术器械：弯钳、文氏钳，手术剪刀、眼科剪、眼科镊、血管镊、血管钳、尖刀片和刀柄、医用棉签小动物呼吸机：HX-300成都泰盟科技微量注射泵：德国braun公司惠普多功能监护仪：美国气体监护仪（Capnomac Ultima）：Datex-Ohmeda芬兰血气分析仪（Stat Profile M7）：NOVA biomedical美国Leica RM2135石蜡切片机：美国Leica公司DYY-IIl31A型电泳仪。凝胶成像及分析系统（2020D）：美国United-Biotechnology公司实验方法一、实验动物分组（一）分组一取健康SD大鼠，雌雄不限，体重250-350g，随机分为10组，1．Fen（芬太尼）组：Fen+24h+麻醉+开胸+I／R2．LPS（脂多糖）组：LPS+24h+麻醉+开胸+I／R3．NS（生理盐水）组：NS+24h+麻醉+开胸+I／R4．Nal+Fen组：Nal+10min+Fen+24h+麻醉+开胸+I／R5．Nal+LPS组：Nal+10min+LPS+24h+麻醉+开胸+I／R6．Nal+NS组：Nal+10min+NS+24h+麻醉+开胸+I／R7．Fen+Nal组：Fen+24h+10min+Nal+麻醉+开胸+I／R8．LPS+Nal组：LPS+24h+10min+Nal+麻醉+开胸+I／R9．NS+Nal组：NS+24h+10min+Nal+麻醉+开胸+I／R10．Con组：24h+麻醉+开胸+I／R（二）分组二1．Fen（芬太尼）组：Fen1．LPS（脂多糖）组：LPS2．NS（生理盐水）组：NS3．Nal+Fen组：NaL+10min+Fen4．Nal+LPS组：Nal+10min+LPS5．Nal+NS组：Nal+10min+NS6．Con组：不给药物分别于最后一次给药后30min、2h、24h，测定p38 MAPK、phospho p38 MAPK的表达。给药方法：均腹腔内给药，Naloxone（纳洛酮）：1mg／kgLPS（脂多糖）：1mg／kgFentanyl（芬太尼）：0.1mg／kg二、动物模型的建立所有大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠60mg／kg，待大鼠对疼痛刺激不再有反应时称量麻醉后体重（g）。将大鼠四肢固定于实验台上，必要时水合氯醛3ml／kg，腹腔注射维持麻醉。颈前正中切口行气管切开，连接小型动物呼吸机行人工通气，维持呼气末二氧化碳分压在35-45mmHg。右颈静脉插管用于静脉注射生理盐水5-10ml·kg^-1·h^-1及给药。右侧颈动脉插管用于测定动脉压。实验过程中通过血气分析监测动脉血pH、氧分压（PO2）、二氧化碳分压（PCO2），并通过呼吸频率及潮气量的调节维持上述指标在生理范围。实验过程中通过电热毯维持肛温在36.5-37.5℃。将针形电极插人四肢皮下，连接多导生理记录仪连续监测心电活动。经胸骨左缘第三、四肋间处开胸，开胸器撑开胸腔，剪开心包，暴露心脏及左室表面血管，以肺动脉圆锥及左心耳交界处的右冠状静脉为标志，在冠状动脉左前降支距左心耳下缘2mm处穿3-0丝线备用，线两端共穿一根聚乙烯小管以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，（缺血时间30min），穿线后稳定20min，放松闭环即发生再灌注损伤，（再灌注时间120min）。实验中以左室前壁紫绀及同步心电图标Ⅱ导联S-T段抬高为结扎成功标志。穿线后稳定20min，记录血流动力学参数作为基础值。所有大鼠在实验结束时从股静脉处收集血液2 ml，以3000×g离心10min，离心后收集上清，置于-70℃保存，待测磷酸肌酸激酶（CK）及乳酸脱氢酶（LDH）含量。三、观察指标及测定方法（一）分组一检测指标1．血流动力学参数变化：分别于稳定后20min，冠状动脉左前降支脉阻断30min，再灌注后60min、120min，监测心电图、MAP、HR等血流动力学参数。2．血液生化指标测定：测定血中磷酸肌酸激酶（CK）及乳酸脱氢酶（LDH）含量变化。3．心肌组织SOD和MDA测定：经羟胺法测定SOD含量，采用荧光分光光度法测定心肌组织中NO含量。4．心肌梗死面积（infart size IS）：伊文氏蓝和三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，干燥后分别称重，测定左心室（LV）、缺血危险区（area at risk，AAR）及梗死区（infarct size，IS）心肌重量（g），以梗死区心肌重量（IS）占缺血区心肌重量百分比作为心肌梗死范围的大小。5．TUNEL法检测心肌细胞凋亡率6．caspase-3活性检测7．Western blot分析：实验结束后，快速摘取心脏，Western blot方法测定细胞色素C、p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK的表达。（二）分组二Western blot分析：最后一次给药后30min、2h、24h摘取心脏，Western blot方法测定p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK的表达。四、统计学处理数据以均值土标准差表示。数据处理采用SPSS 13.0处理，组间比较采用方差分析及Student-Newman-Keuls检验，组内比较采用Student t检验，以P＜0.05为差异有显著性意义。实验结果一、实验过程中大鼠血流动力学参数变化：各组基础MAP，HR值无显著差异（P＞0.05）。关于MAP，在LPS组的再灌注120min时点，LPS+Nal组的再灌注30min、再灌注60min、再灌注120min三个时点，Nal+LPS组的再灌注60min、再灌注120min两个时点，与基础值比较降低，有显著差异（P＜0.05）。与Fen组各时点比较，LPS组在再灌注120min时点，Nal+LPS组在再灌注60min时点降低，有显著差异（P＜0.05）。关于HR，Fen+Nal组在再灌注120min时点，LPS+Nal组在再灌注120min时点，与基础值比较降低，有显著差异（P＜0.05）。MAP和HR随着实验进程有逐渐下降趋势，在有LPS参与的三个组下降更明显。二、各组大鼠血中磷酸肌酸激酶（CK）及乳酸脱氢酶（LDH）含量的变化：与NS组相比，Fen组和LPS组CK及LDH含量明显降低（P＜0.05），Nal+LPS组的CK含量明显降低（P＜0.05），而Nal+LPS组的LDH含量略有降低不明显，但无显著差异（P＞0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组组和Fen+Nal组CK及LDH含量明显升高（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+Nal组CK及LDH含量明显升高（P＜0.05）。三、心肌组织中SOD和MDA含量的变化：与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组SOD含量明显降低（P＜0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组和Fen+Nal组SOD含量明显升高（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+Nal组SOD含量明显升高（P＜0.05）。而MDA含量变化与SOD变化情况相反。四、各组大鼠心肌梗死面积的变化：与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组心肌梗死范围明显缩小（P＜0.05），IS／AAR分别为20±6％，23±8％和29±14％（P＜0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组和Fen+Nal组心肌梗死范围明显增大，有显著差异（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+Nal组心肌梗死范围明显增大，有显著差异（P＜0.05）。五、TUNEL凋亡细胞结果：与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组心肌细胞凋亡率明显减小（P＜0.05），分别为13±3％，12±4％和15±5％（P＜0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组和Fen+Nal组心肌细胞凋亡率明显增大，有显著差异（P＜0.05）。六、各组caspase-3活性：与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组心肌细胞caspase-3活性明显减小（P＜0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组和Fen+Nal组caspase-3活性明显增加，有显著差异（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+Nal组caspase-3活性明显增加，有显著差异（P＜0.05）。七、细胞色素C、p38和phospho p38 MAPK蛋白水平表达的差异：与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组心肌细胞细胞色素C活性明显减小（P＜0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组和Fen+Nal组细胞色素C活性明显增加，有显著差异（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+Nal组细胞色素C活性明显增加，有显著差异（P＜0.05）。各组之间p38 MAPK（总p38 MAPK）蛋白水平无显著差异。Fen组、LPS组和Nal+LPS组的Phospho-p38 MAPK（磷酸化p38 MAPK）水平显著升高：与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组蛋白水平明显升高（P＜0.05）；与Fen组相比，Nal+Fen组和Fen+Nal组蛋白水平明显减小，有显著差异（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+Nal组蛋白水平明显减小，有显著差异（P＜0.05）。8．分组二中不同时点p38 MAPK磷酸化水平的表达：给药后30分钟，Fen组、LPS组和Nal+LPS组的p38 MAPK磷酸化水平显著升高，与NS组相比较有显著差异（P＜0.05），分别为1.83±0.34、2.21±0.44、1.65±0.24。给药后2小时后，各组的p38 MAPK磷酸化水平均降低，与NS组相比较无显著差异（P＞0.05）。给药后24小时后，各组的p38 MAPK磷酸化水平进一步降低，与NS组相比较无显著差异（P＞0.05）。讨论通过缺血或药物预处理的方法，调动机体内源性保护机制来防治缺血／再灌注损伤一直是临床研究的重要课题。至目前为止，多种动物（犬、大鼠等）的整体心脏或离体心肌细胞的实验都证实缺血预处理及一些药物预处理均可诱导出延迟心肌保护作用。Schultz最早发现吗啡能模拟缺血预处理来减少缺血再灌注心肌梗死面积。除静脉注射外，鞘内注射吗啡也同样具有减少梗死面积，减轻缺血再灌注损伤的作用。吗啡还具有延迟的保护作用。吗啡的这种限制心梗范围效应已在不同动物种属的活体、离体及心肌细胞的实验研究中得到证实，吗啡对心肌缺血再灌注损伤的保护效应已经较为肯定。在临床上芬太尼应用比吗啡更普遍，但研究芬太尼预处理的文章很少，这可能与成年大鼠心脏只有δ及κ阿片受体，无μ受体有关。芬太尼为纯μ阿片受体激动剂有关，其实芬太尼也能与δ及κ阿片受体结合。由于心脏无μ阿片受体，故芬太尼介导的心肌保护作用，可能是通过外周及中枢阿片受体而发挥作用的。脂多糖（lipopolysacharide，LPS）是革兰氏阴性杆菌内毒素的主要成分，通过与单核一巨噬细胞相结合而产生广泛的生物效应。用小剂量（亚致死剂量）LPS预先处理各种器官或组织后，也可以诱导出类似的保护作用。在本实验中，单纯应用芬太尼和脂多糖的两个组，心肌梗死面积明显减小，与单纯应用生理盐水组有显著差异，说明芬太尼和脂多糖能够诱导出心肌DPC保护作用本实验通过测定血中磷酸肌酸激酶（CK），乳酸脱氢酶（LDH），心肌组织SOD和MDA来间接反映缺血／再灌后机体受注损伤程度，结果与心肌梗死面积的变化一致，，验证了文献报道。纳洛酮是κ、δ、μ阿片受体阻断剂。在本实验中发现，在应用芬太尼／脂多糖+纳洛酮四个组中，激发期（trigger phase）应用纳洛酮组心肌梗死面积缩小，不能阻断脂多糖产生的保护作用，而其他三组的心肌梗死面积无明显减小，与单纯应用生理盐水类似。大鼠血中磷酸肌酸激酶（CK）的含量变化与心肌梗死面积的变化一致。说明芬太尼产生的DPC保护作用可被激发期和介导期（mediator phase）的纳洛酮阻断，介导期的纳洛酮同样阻断脂多糖的DPC保护作用。而与此不同的是，激发期应用的纳洛酮并没有阻断脂多糖的DPC保护作用。表明在激发期，由脂多糖诱发的DPC保护作用，可以不通过阿片受体起效，但是最后在介导期却必须通过阿片受体。这一现象提示，不同种类药物诱导的心肌DPC保护作用，其信号传导路线可能不尽相同，在这一未知领域可能存在着非常复杂的过程，值得深入研究。大量证据表明I／R后细胞都会发生坏死和凋亡，他们有明显地形态学和生物学特征。IPC可以减少细胞凋亡的现象在在体、离体的器官以及培养的心肌细胞已经得到证实。迄今为止，在DPC领域，关于心肌细胞凋亡的报导还很少，Baghelai等在独立灌注的大鼠心脏模型上诱导DPC，发现心肌细胞凋亡数减少。本实验中，与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组心肌细胞凋亡率明显减小，其变化与心肌梗死面积的变化一致，说明在DPC保护作用中存在凋亡现象，但其机制仍然不清。凋亡的内源性通路中，线粒体通透性转运孔（PTP）打开后，细胞色素C等凋亡信号分子进入胞浆，发挥激活Caspase等的作用，从而导致凋亡的特征性改变。细胞色素C、Caspase-3在细胞凋亡中起重要作用。IPC可通过抑制线粒体通透性来减少细胞色素C的释放，从而减少培养的心肌细胞凋亡。IPC在I／R后可以通过抑制caspase活性来减少细胞凋亡。本实验中观察到，与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组心肌细胞caspase-3和细胞色素C明显减小，与凋亡率的变化一致，说明DPC可以通过下调细胞色素C、Caspase-3来降低凋亡率。多种动物（犬、大鼠等）的整体心脏或离体心肌细胞的实验证实，缺血及一些药物预处理均可诱导DPC。尽管DPC象EPC一样普遍，但其产生的机制尚不清楚。已有报道其机制可能与预处理诱导心肌产生内源性保护物质有关，如热休克蛋白、超氧化物歧化酶、醛糖还原酶、NO合酶、环氧化酶-2等。PKC的激活并转位是产生DPC保护作用的关键环节。蛋白酪氨酸激酶（Portein tyrosine kinase，PTK）可能是参与缺血预处理信号传导途径的另一蛋白激酶。激活的PKC或PTK通过进一步对其下游底物进行磷酸化修饰而产生生物学效应。丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）是一类广泛存在于真核细胞中的丝／苏氨酸蛋白激酶，是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路，包括JNK、p38 MAPK和ERKs三种激酶，激活的MAPK通过磷酸化多种转录因子，细胞骨架蛋白、其他酶类等多种底物来调节多种细胞生理过程，在缺血、缺氧、牵张、细胞因子等多种细胞外刺激诱导基因表达、细胞增殖等核反应的信号通路中起着重要作用。Zhao等发现p38参与了兔和大鼠在应用药物激活A1受体诱导的延迟保护作用，并认为p38通道可作为一个预处理延迟保护作用的终末受动器。在Ting等所做的茴香豆素诱导的延迟保护作用的研究中，发现p38扮演着延迟保护作用触发点的作用。Dana等在兔心缺血再灌注模型上使用腺苷A1受体激动剂CCPA预处理，在显著减少心肌梗死面积同时，还使p38MAPK的活性提高7倍，而这些作用能被提前给予PKC或TK的拮抗剂所取消。另在小鼠心脏上发现p38MAPK的拮抗剂能取消延迟预适应的心肌保护作用。以上资料提示，p38MAPK参与DPC。本实验中观察到，经过缺血再灌注后，与NS组相比，Fen组、LPS组和Nal+LPS组的p38 MAPK磷酸化水平明显增加，与实验一中心肌梗死面积变化一致，提示p38 MAPK参与了心肌DPC保护作用，与文献报道一致。既往的研究很少涉及迟发性预处理中p38 MAPK与时间的变化规律。本实验分别于给药后30分钟、2小时和24小时三个时点取材，而不经过缺血／再灌注，测定p38MAPK磷酸化的情况。结果显示：给药后30min，Fen组、LPS组和Nal+LPS组的p38 MAPK磷酸化水平明显增加，达最大值；2小时后这三组下降明显，24小时后恢复正常。应用纳洛酮的三个组（Nal+Fen组、Nal+LPS组、Nal+NS组），给药后30min后，p38 MAPK磷酸化水平稍有增加，但与NS组无显著性差异；2小时后恢复正常。可见在给药24小时后p38 MAPK磷酸化水平已恢复正常，但仍然产生心肌DPC保护作用，提示：p38 MAPK不是DPC保护作用过程中的终末效应器，必须通过其它物质来发挥作用。关于p38哪些亚型在DPC保护作用中的具体作用、p38与丝裂素活化蛋白激酶中ERK、JNK的相互影响，以及p38与其他信号分子包括PKC、PTK、NF-KB等的相互关系有待进一步研究。结论1．芬太尼、脂多糖均可诱发大鼠心肌的DPC保护作用2．作为激发因子，脂多糖不必依赖于阿片受体即可诱导出大鼠心肌DPC保护作用。3．芬太尼、脂多糖诱导的DPC中存在心肌细胞凋亡并且凋亡细胞减少4．芬太尼、脂多糖诱导的DPC中心肌的细胞色素C、Caspase-3降低，p38 MAPK磷酸化水平增加。5．p38 MAPK参与芬太尼、脂多糖诱导的DPC中，p38 MAPK磷酸化水平在2h时增加明显，24h后降为基础值。