急性肾衰(ARF)是一种以肾小球滤过功能迅速下降为特征的临床综合征。ARF约占全部住院病人的5﹪，而在重症监护病房中ARF更占了所有病人的30﹪。ARF相对较高的发病率是与肾脏的生理结构及功能密切相关的。目前认为，ARF是一种多因素多机制造成的肾脏损害，主要病理生理机制包括小管细胞损伤、。肾内血管舒缩失衡、肾内微血管损伤和中性粒细胞浸润所导致的炎症反应等。目前对于急性。肾衰的治疗仍然以支持治疗为主，在过去30年，尽管对于急性肾衰的支持治疗如持续性肾脏替代治疗(cRRT)有了较大的进步，但并未能显著降低ARF的死亡率。针对ARF的发病机制，临床常用的一系列药物治疗包括袢利尿剂、小剂量多巴胺、内皮素拮抗剂、钙离子阻断剂、前列腺素、抗氧化剂、抗ICAM-1抗体等，因只针对急性肾衰发病机制的其中一个环节，尽管在细胞及动物实验中效果明显，但却无法在临床实践中取得稳定的疗效。生长因子治疗急性肾衰曾被寄予厚望，但这种治疗的局限性在于病人必须有足够的存活细胞才能恢复小管结构的完整性。为了克服这种局限性，近年开展了一种新的治疗措施即通过补充干细胞以促进正常小管上皮细胞取代死亡和严重受损伤的小管上皮细胞。 干细胞作为一种非特异性的细胞，在特定的生理及实验条件下可以被诱导分化为特定组织或器官的细胞。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。在骨髓中含有丰富的成体干细胞，骨髓中的成体干细胞可以分为造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)两类。近年来研究发现成体干细胞可以分化为其组织来源以外的其它细胞系。移植问充质干细胞或造血干细胞后，这些细胞可以分化为心肌细胞、肝脏上皮细胞以及神经外胚层细胞。 在肾脏的研究中也发现，成体干细胞可以参与肾脏细胞的生理性转归。在ARF的动物实验中发现，补充成体干细胞后，成体干细胞可以促进肾小管的修复从而加速急性肾衰肾功能的恢复。 但成体干细胞对于急性肾衰肾小管上皮细胞的保护机制目前仍然存在争论，以往认为成体干细胞转分化为肾小管上皮细胞是其主要保护机制，但最近研究发现成体干细胞可以通过旁分泌产生细胞因子从而促进肾小管上皮细胞的再生和修复。 本研究从体内和体外实验两方面观察间充质干细胞对于肾小管上皮细胞的保护作用，并对其保护机制进行初步探讨。以进一步明确间充质干细胞对急性肾衰肾小管上皮细胞的保护机制，为干细胞治疗急性肾衰提供更多的实验依据。 1．小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定 目的：分离小鼠骨髓间充质干细胞，并通过诱导分化对细胞性质进行鉴定。 方法：采用贴壁细胞分离法从C57BL6/J小鼠骨髓中分离间充质干细胞。观察其细胞形态，并在不同培养条件下诱导所分离的细胞分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞，从而对其间充质干细胞的细胞特征进行鉴定。 结果：贴壁细胞分离法获得的细胞具有问充质干细胞的特点：细胞形态为似成纤维细胞样的细长纺锤形。低密度种植细胞后可以形成集落形成单位。在不同的诱导条件下可以多向分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等。 小结：通过贴壁细胞分离法获得具有多向分化能力的小鼠骨髓间充质干细胞，为下一步研究打下了基础。 2．间充质干细胞在顺铂致小鼠急性肾衰中保护作用 目的：建立顺铂致小鼠急性肾衰的动物模型，观察静脉输入间充质干细胞(MSC)后小鼠肾功能的变化、肾脏病理改变，并通过免疫组化观察肾小管上皮细胞的增殖及凋亡状况，从而明确MSC对于顺铂所致急性肾衰小鼠的保护作用。 方法：建立顺铂致小鼠急性肾衰的动物模型。静脉注射间充质干细胞后观察：小鼠肾功能的变化，光镜及电镜下肾脏病理学改变，Ki-67免疫组化反映小管上皮细胞的增殖情况，．DNA末端标记法反映小管上皮细胞的凋亡情况。 结果：顺铂+MSC组的小鼠在注射顺铂后4至5天BUN水平较顺铂+生理盐水组明显降低，在第7、11及29天，仍可见顺铂+MSC组小鼠BUN水平低于顺铂+生理盐水组小鼠。顺铂+MSC组小鼠肾小管损伤组织学评分与相应时间点顺铂+生理盐水组小鼠相比有显著性差异。电镜观察显示前者近曲及远曲小管超微结构损伤明显减轻，小管细胞脱落区域明显减少。计数Ki．67阳性细胞可见：在注射顺铂后4天，顺铂+MSC组小鼠明显高于顺铂+生理盐水组小鼠；注射顺铂后11天，顺铂+MSC组仍明显高于顺铂+生理盐水组。计数TUNEL阳性细胞可见：注射顺铂后4天，顺铂+MSC组小鼠小管上皮细胞中TUNEL阳性细胞明显少于顺铂+生理盐水组小鼠，计数TUNEL阳性细胞可见两组TUNEL阳性率存在明显差异。小管结构完整性顺铂+MSC组也明显好于顺铂+生理盐水组小鼠。 小结：静脉注射间充质干细胞可以明显改善顺铂所致急性肾衰小鼠的肾功能，加速正常小管结构的恢复，促进急性。肾衰小鼠小管上皮细胞的增殖以及抑制其凋亡。 3．体外细胞培养体系中间充质干细胞对肾小管上皮细胞的保护作用 目的：制备顺铂致肾小管上皮细胞损伤的细胞模型，观察在细胞共培养条件下间充质干细胞对于顺铂致肾小管上皮细胞损伤的保护作用，探讨该保护作用的分子生物学机制。 方法：利用MCT细胞系建立顺铂致肾小管上皮细胞损伤的细胞模型，在MCT细胞培养液中直接加入MSC行直接共同培养，应用一种聚碳酸酯膜嵌套(transwell)使位于transwell中的MSC与位于培养板中的MCT细胞分隔开，但MSC分泌的细胞因子能够通过滤膜进入MCT细胞培养液中，从而实现MSC与MCT细胞的间接共培养。观察MSC对于肾小管上皮细胞的保护作用，包括：肾小管上皮细胞数量的改变；BrdU标记流式细胞仪检测肾小管上皮细胞增殖情况；caspase荧光标记流式细胞仪检测肾小管上皮细胞凋亡情况。通过实时定量PCR方法检测共培养体系中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA水平，应用IGF-1抗体阻断IGF-1作用后再观察肾小管上皮细胞的增殖及凋亡情况，探讨MSC的保护作用机制。 结果：直接共培养组与transwell间接共培养组MCT细胞数量较单纯顺铂组明显增高，两组共培养组与单纯顺铂组相比均存在显著差异。直接共培养组MCT细胞中BrdU阳性细胞数较单纯顺铂组明显增高，两组间存在显著差异。直接共培养组与transwell间接共培养组MCT细胞凋亡及坏死细胞百分比较单纯顺铂组明显降低，两组共培养组与单纯顺铂组相比均存在显著差异。直接共培养组中IGF-1m RNA表达较单纯顺铂组明显升高，存在显著性差异。在直接共培养组的培养液中加入IGF-1抗体后，MSC对于MCT细胞的保护作用明显降低，MSC+IGF-1抗体组中MCT细胞数量较直接共培养组明显减少，而凋亡及坏死细胞百分比明显增高，存在显著性差异。 小结：体外细胞培养显示MSC对于肾小管上皮细胞的保护作用，这种保护作用的机制可能与。MSC分泌IGF-1促进肾小管上皮细胞增殖及抑制其凋亡有关。 结论： 1．静脉注射骨髓间充质干细胞可以促进顺铂所致急性肾衰小鼠肾功能的恢复，这种作用可能与间充质干细胞促进肾小管上皮细胞增殖及抑制其凋亡有关。 2．在顺铂致小管上皮细胞损伤模型中，加入骨髓间充质干细胞共培养，可以促进受损肾小管上皮细胞的增殖及抑制其凋亡与坏死。 3．骨髓间充质干细胞对于肾小管上皮细胞的保护作用与间充质干细胞分泌IGF-1有关。