论文部分内容阅读
心血管系统疾病是威胁人类生命健康的首敌，彻底阐明其发病机理并寻求相应的治疗措施，是当今世界医学界亟待攻克的一项重大课题。近年来的研究证明，以糖尿病为突出临床特征的代谢综合征是心血管疾病的“原凶”。控制糖尿病及代谢综合征的药物正成为心血管系统疾病防治的第一战场。脂联素主要是由脂肪细胞合成和分泌的细胞因子，能够调节糖脂代谢、抗炎症、抗凋亡、抑制氧化/硝化反应，从而直接或者间接地保护心血管系统。肥胖、2型糖尿病患者血浆脂联素下降，其对心血管保护作用也减弱。研究表明，给予外源性脂联素能够改善糖尿病动物胰岛素抵抗，降低血糖、血脂以及减轻动物的心肌缺血再灌注损伤，起到心脏保护作用。脂联素强大的生物学作用，使其有望成为治疗2型糖尿病和心血管疾病的候选药物，但其大规模的生产仍是一个难题。全长脂联素包含4个结构域：信号序列区、可变区、胶原样区及球状区（Globulardomain of adiponectin，gAd），人体正常血液中不仅存在全长型脂联素，同时也存在脂联素球状结构（gAd）；脂联素球状结构在血液中的含量远远小于全长型脂联素，但其降低血糖、改善胰岛素抵抗以及增加脂肪酸氧化的能力要更强于全场型脂联素。因此活性更强、用药剂量更少的gAd成为大规模生产的目标。现阶段使用的脂联素球状结构（gAd）大多数来源于真核（酵母）以及哺乳动物细胞的表达，其制备工艺复杂、产量低、成本高、耗费时间长，极大地限制了其广泛的临床应用。因此建立简便、廉价的gAd制备工艺是其广泛应用于临床的关键。研究目的1.利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的原核表达载体，建立工程菌菌种库，进行中试规模的扩大发酵培养；优化发酵工艺和纯化工艺；并对表达纯化产物进行鉴定。2.通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。实验方法1.从正常人脂肪组织里提取总RNA，反转录合成cDNA，经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd。2.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经低温、低浓度IPTG诱导使其可溶性表达，采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析三步分离纯化，得到不带任何标签高纯度的人源性gAd。3.建立中式发酵工艺和中式纯化工艺，运用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC对重组蛋白进行鉴定。4.通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。实验结果1.成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd，实现了人源性gAd在原核细胞中的表达，优化了发酵工艺，使目的蛋白以可溶性形式表达；2.连续三批发酵生长良好，发酵工艺稳定、可靠；连续三批纯化结果表明，所获蛋白纯度均大于97%，每批可得到纯化产物100mg以上，达到了中试生产的要求，建立了稳定、可靠的中试纯化工艺。3.活性研究结果表明，纯化的人源性gAd能够明显的激活HUVECs中AMPK的磷酸化水平以及对小鼠的心肌缺血再灌注损伤起到保护作用结论1.本研究通过对人源性脂联素球状结构（gAd）原核表达载体的构建、中试规模的发酵与纯化研究，建立了简单、快速、稳定、可靠的生产工艺，获得了高纯度的人源性脂联素球状结构（gAd），通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性。2.该研究为今后的大批量生产以及进行外源性gAd的保护作用的深入研究打下了坚实的基础。