【摘 要】
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为了阐明鸭白细胞介素-8(IL-8)分子特征,获得其重组蛋白,推进禽类IL-8的应用研究,本研究采用同源克隆法首次获得了鸭IL-8基因(Anpl-IL-8),并解析了其基因组结构,表达与鉴定了
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为了阐明鸭白细胞介素-8(IL-8)分子特征,获得其重组蛋白,推进禽类IL-8的应用研究,本研究采用同源克隆法首次获得了鸭IL-8基因(Anpl-IL-8),并解析了其基因组结构,表达与鉴定了Anpl-IL-8重组蛋白(rAnpl-IL-8)。 首先分离了鸭外周血淋巴细胞,采用ConA刺激后,提取其总RNA,构建了cDNA PCR文库。设计了简并引物,并采用RT-PCR法扩增了Anpl-IL-8—基因片断,采用RACE-PCR克隆了Anpl-IL-8基因5′端部分,最后采用Anchored-PCR法扩增了全基因。在此基础上,对Anpl-IL-8的基因组DNA进行了克隆。并设计一对表达引物,亚克隆Anpl-IL-8成熟肽基因,并插入到pQE30表达载体,构建了pQE30/Anpl-IL-8原核表达系。 结果表明,Anpl-IL-8基因共编码103个氨基酸,含21个氨基酸的信号肽和82个氨基酸的成熟肽;与鸡IL-8在核苷酸水平上的同源率是80.9%,氨基酸水平上的同源率是90.3%。基因组结构表明该基因含4个外显子和3个内含子,外显子序列和cDNA序列完全一致,IL-8分子进化树揭示了鸭与其它动物的进化关系。构建的pQE30/Anpl-IL-8重组子转化大肠杆菌JM109后,经诱导表达,得到了rAnpl-IL-8。表达蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经离心、超声破碎、变性、Ni-NTA亲和层析纯化、复性得到了纯的rAnpl-IL-8。Tricine SDS-PAGE电泳分析表明rAnpl-IL-8分子量为9.0kD。 本文为研究Anpl-IL-8在炎症性疾病和免疫应答中的分子作用机理奠定了基础
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