人细小病毒B19（Human parvovirus B19）属细小病毒科细小病毒属,1975年由Cossart首次发现以来,诸多研究证明诸多疾病的发生伴随着B19病毒的感染。B19病毒由一个二十面体衣壳蛋白包裹一条单链DNA（5596bp）组成。是一种无包膜且有许多理化耐受性的病原体,用一般的病毒灭活方法不能阻止其传播。B19病毒基因编码一个主要的非结构蛋白（NS1）、两个结构蛋白（VP1和VP2）和两个小分子量蛋白（7.5kDa和11kDa）。VP1蛋白（83kDa）蛋白末端比VP2蛋白（58kDa）多出227个氨基酸。VP1u蛋白既由这227个氨基酸所组成。VP1u蛋白具有PLA2酶活性,能够水解脂肪酸和磷脂,刺激机体出现免疫紊乱。VP1u蛋白的大部分片段暴露于到病毒表面,可以刺激机体产生中和性抗体。VP1u蛋白在B19病毒感染发病机制中起着关键作用,也有可能成为B19疫苗的首选抗原之一。B19病毒XA株VP1u核苷酸存在着变异,鉴于VP1u蛋白的上述特殊的作用,B19病毒XA株VP1u具有其独特的免疫学特点。2009年,我们研究证实,B19病毒XA株VP1u蛋白免疫动物后可引起动物心脏、肝脏、关节滑膜等组织发生病理改变,并可导致动物体内天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等酶系的升高。这可能与VP1u蛋白的PLA₂活性有关,也可能与VP1u蛋白免疫动物后蛋白与动物细胞蛋白间的分子交叉反应有关。这对VP1u蛋白作为B19病毒疫苗的可行性带来了疑问,鉴于核酸疫苗与普通蛋白疫苗不同,其能在自体细胞中产生外源性蛋白,这种蛋白更像天然分子的蛋白的抗原提成过程与自然感染十分相似,并且可以引发宿主长久的免疫应答,因此,我们进行了本项实验。研究目的:本实验目的是构建B19病毒VP1u基因真核表达载体,通过基因测序及真核转染鉴定VP1u蛋白表达。而后以B19病毒XA株VP1u基因为靶基因构建的真核表达载体免疫动物。对免疫后小鼠心肌组织进行病理检查;通过流式细胞术双标法检测小鼠脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分子数量变化;ELISA法检测免疫后小鼠血清中抗体表达情况,判断其作为核酸疫苗的可能性。实验方法:1.重组质粒pIRES2-EGFP-VP1u的构建从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u。2.重组质粒pIRES2-EGFP-VP1u真核转染及蛋白表达鉴定将重组质粒转染至HeLa细胞,Western blot和免疫荧光检测VP1u蛋白的表达。3.重组质粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫学研究将重组载体pIRES2-EGFP-VP1u及pIRES2-EGFP空质粒及生理盐水分别采用肌肉注射的方法免疫BABL/c小鼠。通过流式细胞术双标法检测小鼠脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞数量,western blot及ELISA方法检测小鼠血清中B19VP1u抗体,并对免疫后小鼠心肌组织行光镜和电镜检查,判断其作为核酸疫苗的可行性。实验结果:1.构建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表达载体,经过双酶切鉴定和基因测序鉴定证明与我们保存的pQE30-VP1u原核表达载体中的VP1u核苷酸相同,没有产生碱基突变。2.经过真核转染重组质粒pIRES2-EGFP-VP1u至HeLa细胞,免疫荧光观察和Western blot技术检测证实,可表达VP1u蛋白。3.经重组质粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫的BABL/c小鼠脾脏CD4⁺T细胞产生了明显的变化,在接种疫苗第二、三个月发生明显变化,第四个月后CD4⁺T细胞逐渐回复正常,而CD8⁺分子未产生明显变化。小鼠心肌组织经光镜及电镜检查未提示病理变化。通过我们构建的ELISA检测体系可检测到特异的抗B19病毒VP1u抗体。结论:1.本实验成功构建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表达载体,体外实验证实其可在Hela细胞中表达VP1u蛋白。2.重组质粒免疫BALB/c小鼠后,经ELISA检测能产生特异性抗体,心肌组织经光镜和电镜检查未发现病理变化,提示重组质粒免疫动物后未引起自身免疫紊乱。3.流式细胞术双标法检测小鼠脾脏CD4⁺和CD8⁺TT细胞数量后,发现重组质粒pIRES2-EGFP-VP1u可以使免疫动物脾脏脾淋巴细胞CD4⁺T细胞发生变化。