基于酪氨酸酶抑制活性的木蝴蝶质量控制研究

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第一部分:响应面法优化超声辅助提取木蝴蝶中总黄酮成分目的:建立响应面法优化超声辅助提取木蝴蝶中总黄酮成分的最佳提取条件。方法:采用超声辅助提取,应用Box-Behnken设计,以甲醇浓度,提取时间和液固比作为研究因素,以总黄酮含量(TFC),抗氧化活性(DPPH,ABTS,FRAP,超氧阴离子和羟基自由基)和酪氨酸酶抑制活性作为反应因素,对木蝴蝶总黄酮的提取条件进行了优化,并采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS方法对优化条件下所得提取液中的主要黄酮类化合物进行了鉴定。结果:最佳提取条件为:甲醇浓度为69.90%,提取时间为30.64 min,液固比为31.30 m L·g-1,TFC,DPPH,ABTS,FRAP,超氧阴离子自由基,羟基自由基清除活性和酪氨酸酶抑制活性的结果分别为19.79 mg RE·g-1,78.66%,99.92%,19.05 mmol·L-1 FE·g-1,20.49%,13.37%和35.13%。通过UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS分析,木蝴蝶提取液中主要的黄酮类化合物分别是木蝴蝶苷B,黄芩苷,木蝴蝶苷A,黄芩素和白杨素。结论:超声辅助提取法可有效的从木蝴蝶中提取黄酮类化合物。第二部分:超滤亲和结合液相色谱-质谱联用和分子对接技术筛选木蝴蝶中酪氨酸酶抑制剂成分目的:建立有效筛选和鉴定木蝴蝶提取液中酪氨酸酶配体的方法。方法:采用超滤并结合高效液相色谱结合二极管阵列检测器和飞行时间质谱与分子对接技术,对木蝴蝶提取液中的酪氨酸酶抑制剂成分进行筛选和鉴定。首先将样品与酪氨酸酶一起孵育,孵育后对混合溶液进行超滤离心,通过比较活化和灭活酪氨酸酶的超滤液图谱,分析得到潜在的抑制剂成分。结果:通过实验发现7种潜在的酪氨酸酶抑制剂,活性分析表明,与阳性对照药白藜芦醇相比,木蝴蝶苷A和黄芩素对酪氨酸酶的抑制活性更高,并通过分子对接技术进一步验证了它们与酶的结合模式。结论:超滤亲和结合液相色谱-质谱联用技术为中药筛选生物活性化合物提供了有效的方法。第三部分:组织破碎低共熔溶剂提取木蝴蝶中主要黄酮类活性成分目的:建立一种绿色快速的木蝴蝶质量控制方法。方法:以低共熔溶剂为提取溶剂,采用组织破碎提取法对木蝴蝶中四种生物活性黄酮类化合物进行了高效、绿色的提取,在液固比,提取转速和提取时间等单因素实验的基础上,采用Box-Behnken设计对提取条件进行了优化,并建立了一种UPLC方法对其进行灵敏、选择性的定量分析。结果:低共熔溶剂体系组成为氯化胆碱/1,4-丁二醇,摩尔比为1:3,水含量为40%。提取条件为固液比为20 mg·m L-1,提取转速为5,提取时间为1 min。通过将组织破碎提取和UPLC结合使用,仅需6 min即可完成黄酮类化合物的分析。结论:组织破碎低共熔溶剂提取法为天然产物中活性化合物的提取和分析提供了一种超快速环保、有潜力的替代方法。
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