纤维素酶在木质纤维素生物质利用中具有举足轻重的地位,而开发具有优良性状的纤维素酶对提高木质纤维素生物质的利用效率有极大的促进作用。本实验室从中国东海海域污泥中筛选分离得到的一株黑曲霉(Aspergillus niger ZJUBE-1)具有耐盐生长特性;其生产的纤维素酶具有较强的耐盐特性,在造纸废水处理、海洋纤维素资源利用、盐碱地土壤的改良等方面具有潜在的应用价值。本文以海洋黑曲霉ZJUBE-1为研究对象,旨在从其纤维素酶复合物中挖掘出具有耐盐特性的单一纤维素酶组分。通过在上游过程中引入分离因子,即同源组成型表达,来定向表达目标纤维素酶组分,方便下游过程中纤维素酶组分的分离纯化,达到高效分离获得单一纤维素酶组分的目的;通过氨基酸组成分析、关键残基分析以及分子动力学模拟分析,对分离得到的具有特殊性状的纤维素酶组分进行机理的探讨分析。主要研究结果如下:(1)建立并优化了根癌农杆菌介导转化海洋黑曲霉的遗传操作方法,通过根癌农杆菌介导转化的方法构建了组成型表达自身纤维二糖水解酶(Ce16、Cel7A和Ce17B)、内切葡聚糖酶(EGL)和β-葡萄糖苷酶(BGL1和BGL2)的重组海洋黑曲霉,在上游过程中引入了同源组成型表达作为高效获得单一纤维素酶组分的分离因子。以高表达BGL1重组菌株为实验对象,对其培养基组成和培养条件进行单因素优化,使发酵液中目标纤维素酶组分含量明显增加,杂蛋白含量降低。在不添加纤维素酶诱导物进行发酵时,组成型表达的纤维素酶是发酵液中主要的蛋白成分。随后,通过阴离子交换层析获得了六个高纯的单一纤维素酶组分,证明了在上游过程中引入分离因子后快速获得单一纤维素酶方法的可行性。(2)对纯化后的Cel6、Cel7A、Cel7B、EGL、BGL1和BGL2六个纤维素酶组分进行了酶学性质的研究。发现Ce17B在pH 5.0以上时具有良好的热稳定性,其耐热性可以与嗜热菌来源的耐热纤维素酶相媲美;EGL具有耐盐特性,在4.5 M NaCl条件下的酶活比无NaCl存在时提高了 29%,且在高盐环境中其热稳定性明显增强,随着NaCl浓度的增加,其在65℃的酶活半衰期从20 min提高到了180 min;BGL2具有耐盐特性,在4 M NaCl条件下的酶活比无NaCl存在时提高了40%。(3)对耐热和耐盐纤维素酶进行静态(氨基酸组成、底物结合和催化关键残基)和动态(分子动力学模拟)分析,提出了相应的耐盐和耐热机理。其中,Cel7B蛋白分子中带电残基比例较高,在高温下可以形成更多的盐桥,复杂的盐桥网络防止了蛋白结构的剧烈变化,进而赋予其耐热特性。在常温下,盐离子与EGL的loop区相互作用,增加了其loop的活跃程度,使其更加容易与底物结合,从而赋予其耐盐特性。在高温下,Na+与EGL的底物结合口袋形成-COO-…Na+…-OOC-型离子键,而高盐环境提供的浓度差可以有效阻止Na+逃逸出口袋,进而防止口袋因过剩的负电荷而过度扩张;另外,高盐造成的静电屏蔽效应使loop所受的作用力变得简单,从而增强了loop的稳定性。高盐对口袋和loop的稳定性的提升赋予了 EGL在高盐下的耐热特性。BGL2底物结合口袋中过剩的Glu492以及loop上的负电残基有效减弱了高盐造成的静电屏蔽;Na+与loop间形成盐桥,使loop趋于稳定。静电屏蔽的减弱以及loop的相对稳定赋予了 BGL2耐盐特性。(4)在诱导条件下,对六种重组海洋黑曲霉进行产纤维素酶性能的研究。相比于出发菌株纤维素酶,过表达自身的纤维二糖水解酶Cel6、Cel7A和Cel7B后,重组子纤维素酶总酶活分别提高了 80%、70%和63%;过表达自身内切葡聚糖酶EGL后,其纤维素酶总酶活提高了 68%;而过表达自身的β-葡萄糖苷酶BGL1和BGL2后,其纤维素酶总酶活则有所降低。分别将cel6、cel7a和cel7b重组子与egl重组子混合培养后,相比于出发菌株纤维素酶,混合菌纤维素酶总酶活分别提高了 114%、102%和91%。结果表明纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶是提高纤维素酶总酶活的关键酶组分。此外,在海洋黑曲霉纤维素酶中添加耐盐纤维素酶组分后,混合酶的耐盐性能得到加强,证明了海洋黑曲霉纤维素酶具有更加耐盐的特性与其中的耐盐纤维素酶组分密切相关。