甲基化CpG结合蛋白2(Methyl-CpG binding protein-2，MeCP2)作为DNA甲基化结合蛋白家族中的成员之一，在表观调控中枢神经系统的发育过程中起着极其重要的作用。X染色体上MeCP2基因突变会导致Rett综合征(Rett syndrome，RTT)，主要表现为婴儿（多为女性）出生早期发育正常，但在6-18月之后出现严重的认知下降、自闭行为、僵化运动及癫痫。早期研究发现，MeCP2能够与基因启动子上的甲基化CpG结合，通过募集转录抑制复合物或直接干扰转录因子与启动子的结合，抑制基因转录。进一步研究发现，MeCP2在神经元不同活化状态下可以发生各异的特异位点磷酸化，如Serine80(S80)，Serine421(S421)，这种磷酸化修饰通过调节MeCP2与靶基因启动子的结合与解离，使得MeCP2的转录调控功能在“开”“关”两个状态间即时切换，进而达到高效快速调控基因表达的作用。基于RTT发病特点及磷酸化修饰在MeCP2功能调节中的重要作用，本实验采用不同出生时间的新生大鼠为研究对象，对MeCP2的不同位点磷酸化修饰形式在大鼠脑发育过程中的表达变化、胞内定位、细胞分布及其转录调控功能进行了较为细致的研究。研究结果主要分为以下几方面:　　1.在大鼠脑发育过程中，不同位点磷酸化MeCP2的表达量随发育进行发生显著变化　　针对RTT发病时程特点，我们采用western blot方法，首先观察了皮层中不同丝氨酸位点磷酸化MeCP2在大鼠不同年龄点，即胚胎18天(Embryonic day18，E18)、出生后1天(Postnatal day1，P1)、7天、14天、30天的表达变化特点。结果显示，出生早期(P1)，非磷酸化MeCP2(non-phosphorylated MeCP2，npMeCP2)、丝氨酸80位点磷酸化（phosphorylated serine80，pS80）MeCP2、丝氨酸292位点磷酸化（phosphorylated serine292，pS292）MeCP2均仅有少量表达;随着发育进行，它们的表达量均逐步增加(P7，P14)。与之不同，丝氨酸421位点磷酸化（phosphorylated serine421，pS421）MeCP2在P1、P7、P14均有较高水平表达。值得注意的是，在P30时， pS421、pS292 MeCP2表达量急剧下降，而npMeCP2、pS80MeCP2表达则继续增加。此外，小脑的western blot结果同样显示，在P30时，pS292 MeCP2显著减少而npMeCP2明显增多。同时，免疫组织化学单标结果显示，MeCP2不同位点磷酸化修饰形式在皮层各层中、海马各区中以及小脑中也具有各自特异的、随发育进行而表达变化的特点。以上结果表明，在新生大鼠脑中，不同位点磷酸化MeCP2的表达随发育进行发生改变，提示MeCP2在大鼠脑的发育过程中可能具有一定的作用，并且其作用与其位点特异的磷酸化修饰具有一定的关系。　　2.MeCP2的不同磷酸化形式具有各异的胞内定位特点:　　有研究显示，不同丝氨酸位点的磷酸化修饰能够改变MeCP2与靶基因的结合。因此，为了明确这种结合能力的改变是否与其胞内分布有关，我们首先采用细胞核浆蛋白分离提取技术结合Western blot半定量方法，研究了四种不同丝氨酸位点磷酸化MeCP2的胞内定位情况。结果显示，pS421、pS292 MeCP2特异性地分布于细胞浆组分中，而npMeCP2及pS80 MeCP2则主要分布于细胞核组分中。免疫荧光共聚焦结果进一步证实，pS421、pS292MeCP2主要定位于核外周(DAPI)，而npMeCP2及pS80 MeCP2则几乎集中表达在核内。以上结果提示，不同位点的磷酸化修饰可能通过改变MeCP2的胞内定位来影响MeCP2的功能。　　3.MeCP2的各种磷酸化形式主要表达在神经元中，但有少部分pS292表达于星形胶质细胞中:　　为了明确MeCP2主要在脑内何种细胞中发挥作用，我们进行了不同位点磷酸化MeCP2与神经元(NeuN)及星形角质细胞(GFAP)标记物在皮层、海马及小脑的免疫荧光共聚焦扫描。结果显示，在皮层中，pS421、pS292MeCP2主要表达于神经元胞浆中，而npMeCP2及pS80MeCP2则大多表达在神经元胞核中。值得注意的是，部分星形胶质细胞中也可见pS292阳性染色;此外，pS292在神经突起上也有显著表达，提示其可能具有更为复杂的作用。另一方面，在海马DG区，npMeCP2及pS292MeCP2也主要表达在神经元中;但在出生14天时，也可观察到较多pS292阳性的星形胶质细胞，并在出生30天时，可见一些npMeCP2阳性的星形胶质细胞。同时，在小脑中，四种MeCP2磷酸化形式大多表达在浦肯野细胞层中，但出生30天时，npMeCP2和pS80MeCP2在分子层中出现大量阳性染色。以上结果表明，MeCP2及其不同磷酸化修饰形式主要分布在神经元中，提示其可能在脑内神经元的发育过程中发挥着极为重要的作用。　　4.不同位点磷酸化的MeCP2能够与神经元标记基因启动子相结合　　目前研究普遍认为，MeCP2能够与基因启动子上的甲基化DNA相结合来调节靶基因转录。鉴于MeCP2的不同磷酸化形式主要表达在神经元中，因此，为了验证npMeCP2及pS80、pS421、pS292 MeCP2与甲基化DNA的结合能力，我们采用染色质免疫共沉淀(ChIP)方法结合实时定量PCR技术(ChIP-qPCR)，检测了出生14、30天时皮层中四种MeCP2与dcx、map-2或gfap（对照）基因启动子的结合能力及变化情况。结果显示，在出生14、30天的皮层中，npMeCP2及pS292、pS421、pS80 MeCP2均能与dcx、map-2及gfap基因启动子相结合，且随发育进行，其结合能力均有不同程度的增强。值得注意的是，pS80 MeCP2的结合能力高于npMeCP2及pS292、pS421 MeCP2;而npMeCP2的结合能力在出生14天时与pS292、pS421MeCP2相近，但在出生30天时略高于后两者。以上结果提示，不同丝氨酸位点的磷酸化修饰可能影响了MeCP2与靶基因启动子的结合能力，进而影响其转录调控作用。　　5.在大鼠脑发育过程中，MeCP2靶基因的转录及翻译量发生显著变化　　为了明确发育过程中MeCP2靶基因的转录、翻译是否发生变化，我们采用RNA逆转录PCR方法结合实时定量PCR技术(RT-qPCR)，检测了大鼠出生后7、14、30天时皮层和小脑中dcx、tuj1、map-2及gfap基因的转录变化情况，同时应用western blot方法，观察了发育过程中神经细胞标记蛋白的表达变化情况。结果显示，在皮层和小脑中，dcx和tuj1的mRNA水平随发育进行显著下降，而map-2及gfap mRNA含量逐渐增多。同时，western blot的蛋白半定量结果显示了类似的变化特点。以上结果提示，在发育过程中，MeCP2靶基因的转录和翻译水平均发生了显著改变，提示MeCP2可能参与了其转录调控过程。　　6.抑制内源性MeCP2表达能够影响神经细胞标记蛋白的表达　　为了明确MeCP2是否参与了dcx、tuj1、map-2及gfap基因的转录调控过程，我们采用出生后7天大鼠延髓池注射MeCP2 shRNA质粒结合western blot半定量分析的方法，检测了脑发育至14、30天时小脑内神经元标记蛋白(DCX，Tuj1，MAP2)及GFAP的表达变化情况。结果显示，与对照组相比，出生14天时npMeCP2显著减少，同时，GFAP表达显著下降，而DCX，Tuj1，MAP2无明显变化。与之不同，出生30天时，npMeCP2含量无明显改变，但DCX和Tuj1含量显著减少， MAP2表达明显增加，而GFAP无明显变化。以上结果表明，MeCP2参与了dcx、tuj1、map-2及gfap基因的转录调控过程，提示MeCP2在脑发育过程中发挥着重要作用。　　结论:　　1.在大鼠脑发育过程中，npMeCP2及pS80、pS421、pS292MeCP2的表达具有各自特异的变化特点。　　2.在大鼠脑发育过程中，npMeCP2、pS80MeCP2与pS421、pS292MeCP2具有不同的胞内核浆定位特征。　　3.在大鼠脑发育过程中，npMeCP2及pS80、pS421、pS292MeCP2主要表达在神经元细胞中，并参与了神经细胞标记基因的转录调控过程。