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研究背景：恶性肿瘤是人类死亡的主要原因。口腔鳞状细胞癌每年新发病例超过30万。尽管手术、放疗和化疗技术不断进步,患者的五年生存率一直维持在50%到60%左右。为了提高治疗效果,科学家针对与肿瘤发生发展密切相关的肿瘤微环境做了大量的研究工作。在包括口腔鳞状细胞癌在内的实体肿瘤微环境中低氧与炎症是两大重要的特征。肿瘤低氧是由于肿瘤内的血供不能满足肿瘤快速增殖的需要。肿瘤低氧与肿瘤的增殖、不良预后密切相关。这主要是由于低氧可以促进与细胞增殖等相关基因的表达。肿瘤微环境的另外一个特征就是炎症,它能起到促进肿瘤发展的作用。核因子κB是炎症反应中重要的转录因子,是联系炎症和肿瘤的重要纽带。核因子κB的活化可以促进多种抗凋亡基因的表达,所以抑制核因子κB具备治疗肿瘤的潜能。然而在实体肿瘤中以核因子κB为靶点的治疗并不能去的很好的效果。这可能与肿瘤的微环境密切相关,一旦炎症信号通路被抑制之后,存在其他的信号通路可以刺激核因子κB的表达。近期,肿瘤低氧被认为可以起到促进核因子κB活化的功能,然而低氧调控核因子κB机制还不清楚。本文主要证实口腔鳞状细胞内TLRs/NF-κB信号通路与HIF-1信号通路之间正向的调控体系,将肿瘤微环境中的低氧信号通路与炎症信号通路联系在一起。实验结果将帮助我们进一步认识肿瘤微环境中低氧与炎症的关系,并为口腔鳞状细胞癌的治疗提供更加完善的理论基础。第一部分TLR3,TLR4,HIF-1在口腔鳞癌患者肿瘤组织中的表达,及其与患者临床病理参数,预后的研究目的探讨在口腔鳞癌患者肿瘤组织中HIF-1,TLR3,TLR4的表达与患者临床病理学参数及预后的关系。方法选取南京大学医学院附属口腔医院颌面外科收治的90例口腔鳞癌患者肿瘤组织标本,采用免疫组织化学方法检测口腔鳞癌组织中TLR3,TLR4,HIF-1表达水平,并与患者术后随访资料,临床病理学参数进行比较分析,绘制患者Kaplan-Meier生存曲线并通过log-rank秩和检验研究HIF-1,TLRs表达与预后的关系。结果口腔鳞癌患者肿瘤组织中表达的TLR3,TLR4,HIF-1与患者的生存时间、患者组织学分级密切相关。第二部分HIF-1表达对低氧微环境中口腔鳞癌细胞生物学行为影响的研究目的 明确口腔鳞癌细胞株在低氧微环境中表达的HIF-1对肿瘤细胞的影响。方法通过慢病毒载体构建HIF-1α稳定低表达的肿瘤细胞,CCK8细胞增殖实验、流式细胞术实验、细胞迁移实验检测低氧微环境对口腔鳞癌细胞的作用及HIF-1在其中的地位。结果 低氧微环境中口腔鳞癌细胞通过稳定细胞内的HIF-1α表达促进细胞增殖,迁移,抑制细胞凋亡的效应。第三部分口腔鳞癌微环境中TLRs/NF-κB对HIF-1的调控作用及其机制研究目的探究口腔鳞癌细胞内TLRs/NF-κB信号通路对HIF-1表达的作用及机制。方法明确TLR3，TLR4在肿瘤细胞的表达,研究激活TLR3，TLR4对HIF-1的作用,并证明TLR3，TLR4是否通过NF-κB激活HIF-1的表达,构建HIF-1的报告基因质粒进一步验证TLR3,TLR4通路对HIF-1的作用。将HIF-1的启动子区序列克隆进萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL-3中,检测使用TLR3,TLR4配体后荧光素酶的释放水平。结果 口腔鳞癌组织及细胞内表达TLR3，TLR4通过激活下游的NF-κB从而促进HIF-1的表达。第四部分口腔鳞癌微环境中HIF-1对TLRs/NF-κB的调控作用及其机制研究目的研究口腔鳞癌细胞低氧条件下TLRs/NF-κB表达变化及HIF-1的作用。方法检测低氧微环境中TLRs/NF-κB信号通路的表达变化及HIF-1作用。通过染色质免疫共沉淀明确HIF-1在TLR3,TLR4启动子区功能性的结合位点。结果低氧条件下HIF-1可通过与TLR3,TLR4启动子区的结合从而促进TLRs/NF-κB的表达。第五部分联合抑制HIF-1,NF-κB对口腔鳞癌疗效的应用研究目的探讨应用HIF-1,NF-κB联合抑制策略对口腔鳞癌治疗的作用方法制备裸鼠荷瘤模型,分为对照组,单独抑制HIF-1组,单独抑制NF-κB组及联合抑制组,每组10只。实验结束后比较瘤体肿瘤,并对免疫组化分析,免疫组化分析指标为：HIF-1 a,TLR3,TLR4,VEGF,Ki67,NF-κB。结果与单纯抑制HIF-1或NF-κB组相比,在裸鼠荷瘤模型中,联合抑制HIF-1与NF-κB可极大抑制口腔鳞癌组织的生长,而与肿瘤增殖等相关的免疫组化指标明显被抑制。