论文部分内容阅读
青春期启动的时间和模式受个体健康状况、营养和生长以及环境因素的影响,研究表明青春期启动是一个复杂的生物学过程,受多个不同的调节系统控制,由“下丘脑-垂体-性腺”轴(HPGA)执行。本试验通过饮水暴露分别建立了砷[0mg/LAs(Ⅲ)、0.15mg/L As(Ⅲ)、1.5mg/LAs(Ⅲ)、15mg/LAs(Ⅲ)]、氟(100mg/LNaF)及氟砷联合[0.15mg/L As(Ⅲ)+100mg/LNaF 组、1.5 mg/L As(Ⅲ)+100 mg/LNaF 组和 15 mg/L As(Ⅲ)+100mg/L NaF]的ICR小鼠模型,采用阴道涂片、石蜡切片HE染色、Western Blotting、实时荧光定量PCR(real-timeqRT-PCR)、免疫组化和ELISA等实验技术开展系列实验。结果如下:1.母鼠砷、氟及其联合暴露后,整个试验过程中,试验小鼠的摄食、饮水、精神状态、孕期及产子数均正常,与对照组相比没有统计学意义。雌性子代脏器比结果显示:与对照组相比,砷和氟砷联合暴露组的卵巢组织脏器系数在青春期显著升高,而成熟期显著降低;氟暴露组的子宫脏器系数在青春期显著降低;高浓度砷和氟砷联合暴露组的肝脏脏器比在青春前期和青春期启动时均显著降低;而氟及氟砷联合暴露使青春期启动时的雌性子代脾脏系数显著升高;卵巢HE染色结果表明砷暴露组的细胞核大小不均、部分核固缩、核破裂,细胞质减少,间隙增宽。结果表明,各浓度的砷、氟及其联合对脏器造成了不同程度的影响,其中卵巢最为严重。2.阴门开张试验结果表明,与对照组相比,各浓度砷暴露组阴门开张时间均显著提前,说明本试验中的各浓度砷暴露母鼠使雌性子代小鼠的青春期启动时间显著提前,也提示了砷的雌激素样效应;而氟及氟砷联合暴露后导致部分雌性小鼠阴门外观发育不良,推测可能是因为Leptin或Lentin-R不足所致。3.采用real-time PCR、Western Blotting及ELISA技术研究了母鼠砷、氟及其联合暴露后,青春期相关基因kiss-1、GnRH1、Oct2和Ttf1在不同发育阶段的表达。结果表明,砷暴露组与对照组相比,(1)Kiss-1基因的表达:中浓度和高浓度砷暴露组在哺乳期显著降低;高浓度组在青春前期和青春期启动时的表达显著升高;Kisspeptin蛋白表达和基因趋势基本一致,高浓度暴露组在青春期的表达显著高于对照组;(2)GnRH1的基因表达:砷暴露组在哺乳期均显著降低;青春期启动时的基因表达均显著升高;对应的青春期启动时的GnRH蛋白表达显著高于对照组,成年期的基因和蛋白表达与对照组相比均没有统计学意义;(3)Oct2的表达水平:高浓度砷暴露组的基因和蛋白在青春期均显著升高;成年期的基因和蛋白表达均显著降低;(4)Ttf1的基因表达:青春前期和青春期启动时高浓度暴露组显著升高,成年期则显著降低;蛋白的表达变化趋势与基因一致。此结果显示青春期启动时kiss-1、GnRH1、Oct2和Ttf1的基因和蛋白表达水平显著升高,说明母鼠砷暴露可使雌性子代的青春期启动显著提前。(5)而氟及氟砷联合暴露后,其雌性子代的青春期启动相关基因kiss-1、GnRH1、Oct2和Ttf1的表达却显著低于对照组,说明氟与砷在对青春期启动方面的作用是相互拮抗的。4.采用real-time PCR、ELISA和免疫组化技术研究了母鼠砷、氟及其联合暴露后,雌性子代的Leptin、Leptin-R、POMC和NPY基因及相关激素在不同发育阶段的表达。结果表明母鼠暴露不同浓度的砷后,与对照组相比:(1)基因Leptin的表达在青春前期和青春期启动时均显著升高;对应的青春前期和青春期启动时的免疫组化结果和基因趋势一致,暴露组的阳性表达明显高于对照组;(2)基因Leptin-R的表达,高浓度暴露组在青春前期和青春期启动时显著升高;对应的青春前期和青春期启动时的免疫组化结果基本和基因趋势一致,暴露组的阳性表达明显高于对照组;(3)基因POMC的表达,高浓度暴露组在春春前期的表达量显著升高,青春期的表达却显著降低;(4)基因NPY的表达与对照组相比没有统计学意义。(5)氟及氟砷联合暴露后,雌性子代的Leptin、Leptin-R、POMC、NPY在青春期的基因表达均显著降低。(6)母鼠砷暴露后,雌性子代相关激素的结果表明,高浓度砷暴露组的雌性子代在青春期启动时LH水平显著高于对照组,FSH水平与对照组相比没有统计学意义;3β-HSD在青春前期和青春期启动时的表达量均显著高于对照组。结合相关文献报道,可推测在HPG轴中,瘦素水平的升高可能是青春期启动的最早信号,并促进HPG轴的激活,从而增加了性类固醇的分泌以及随后的GH/IGF-I轴的激活。综上所述,母鼠砷暴露,可通过Kiss-1相关基因和Leptin相关基因的促进作用,刺激相关激素水平分泌增加,导致雌性子代的阴门提前开张、青春期启动提前;而氟及氟砷联合暴露后,Kiss-1相关基因和Leptin相关基因的表达量均显著下降。结果提示Kiss-1相关基因和Leptin相关基因在雌性小鼠青春期启动的过程中起着非常重要的作用,而一定量的砷对此有促进作用,氟有抑制作用。