乳酸(2-Hydroxypropanoicacid,2-羟基丙酸)是细胞中摄取的葡萄糖进行糖酵解过程中通过乳酸脱氢酶将丙酮酸转换而成的一类含有羟基的羧酸。乳酸同时存在同分异构体,左旋乳酸和右旋乳酸,其中左旋乳酸是主要成分。在人体中进行的各种新陈代谢和运动中虽然会不断的产生乳酸,但是其浓度一般不会毫无控制的上升。事实上乳酸曾经被认为是无氧代谢的废物,然而现在已知在有氧条件下会不断形成乳酸。在脑内,星形胶质细胞是摄取葡萄糖发生糖酵解过程的主要场所,因此星形胶质细胞也是脑内产生乳酸的主要场所。随着研究发现,在脑内星形胶质细胞和脑内产生的乳酸起着为神经元提供能量的作用,这一发现也被称为星形胶质细胞-神经元-乳酸穿梭假说,除此之外,羟基羧酸受体1(hydrocarboxylic acid receptor 1,简称HCAR1或HCA1)也被发现作为乳酸的特异性受体,因此乳酸现在研究普遍认为在脑内具有作为主要能源,主要糖原异生前体和信号分子的作用,而不是仅仅作为无氧代谢的废物。HCAR1(羟基羧酸受体1,hydrocarboxylic acid receptor 1)也被称为G蛋白偶联受体81(GPR81),最早在脂肪细胞中发现其是可通过生理浓度的乳酸盐和HCAR1激动剂3,5-二羟基苯甲酸酯进行激活从而降低cAMP水平的一类GPCR(G蛋白偶联受体),也是乳酸的特异性受体。研究发现大脑中存在乳酸盐受体,这表明乳酸盐特别是L-乳酸在脑内除了是代谢物和能量底物外,还是一种信号传导物质,然而L-乳酸信号对脑功能的影响尚未研究透彻,本文重点也是研究L-乳酸作为信号对脑内分布较广的星形胶质细胞的作用,探究L-乳酸对星形胶质细胞的信号作用是否会影响神经退行性疾病的发生或者发展。神经退行性疾病被认为是神经元结构和功能逐渐丧失为主要病理特征,并且这一现象随着时间的推移而发生恶化,包括神经元的死亡和胶质细胞之间的平衡紊乱,急性神经退行性病和慢性神经退行性病是两种主要类型的神经退行性疾病,前者主要包括中风和脑损伤等;后者主要包括帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症、亨廷顿病、肌肉萎缩侧索硬化症等。虽然这类疾病的病变部位及病因有着各自不同的具体的病理原因,但伴随着神经细胞的退行性病变却是它们的共同点,其中胶质细胞中的星形胶质细胞的功能紊乱和反应在神经退行性疾病的发生和发展中有着重要的作用,因此星形胶质细胞同样是研究神经退行性疾病过程中的重要一环。星形胶质细胞是脑内分布最广泛的一类细胞,也是胶质细胞中体积最大的一种细胞。神经元与神经胶质细胞之间复杂而平衡的双向稳定是中枢神经系统(CNS)的发育的重要基础环境。星形胶质细胞具有分泌营养因子保护和支持神经元的作用,在通过谷氨酸摄取清除谷氨酸等神经递质以及调节突触间隙中的K+中均起着至关重要的生理作用。在星形胶质细胞结构上表达谷氨酸转运蛋白(EAAT)和水通道蛋白4(AQP4)水通道,它们同样也会参与脑内生理功能和影响神经退行性疾病(ND)的发展和发生。除此之外,星形胶质细胞是脑内摄取葡萄糖并发生糖酵解产生L-乳酸的主要场所。在最早发现的脂肪细胞中,自身的乳酸作用于脂肪细胞中的HCAR1,从而引起脂肪细胞中cAMP的下调,抑制脂肪的分解和炎症的发生。因此作为脑内分布最为广泛的一类细胞,自身产生的L-乳酸与外界通过淋巴胶质系统进行外界交换进入血脑屏障的乳酸盐对星形胶质细胞中HCAR1的信号传导作用成为本文实验研究聚焦的重点。保护星形胶质细胞和星形胶质细胞对神经元的支持作用对改善神经退行性疾病起着至关重要的作用。近几年,随着研究发现乳酸可以作为一种参与突触可塑性的细胞间信号分子,甚至因此乳酸外周给药可以产生抗抑郁的药理作用。在这里,我们的研究聚焦于脑内分布最广泛的星形胶质细胞上的HCAR1,发现并验证了乳酸可以通过HCAR1引起星形胶质细胞中细胞活性调节蛋白Arc的过量表达。然而Arc的表达不依赖于HCAR1的Gi蛋白途径,我们研究发现乳酸是通过HCAR1-β-arrestin2途径增强乳酸对Arc蛋白的表达。总而言之,乳酸作用于星形胶质细胞HCAR1,并通过β-arrestin2增强了 MAPK依赖性的Arc的表达,从而减少星形胶质细胞面对谷氨酸损伤时钙离子的内流,进而达到保护星形胶质细胞的作用,可能间接增强星形胶质细胞对谷氨酸的摄取,也暗示了脑内HCAR1作为改善谷氨酸损伤时造成的神经退行性疾病的潜在靶点。目的:研究并阐明乳酸通过HCAR1减轻星形胶质细胞谷氨酸损伤的作用及其机制方法:使用出生3天左右的C57BL/6J新生小鼠和β-arrestin2基因敲除的新生小鼠进行原代星形胶质细胞的提取。通过原代星形胶质细胞体外培养,传代两次后通过使用星形胶质细胞活化的标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)检测星形胶质细胞阳性率大于95%后用于实验。本实验过程主要对对照组和实验组使用L-乳酸刺激检测相关指标。1.通过使用野生型小鼠脑片进行免疫组化检测HCAR1在脑组内的分布情况,并通过小鼠海马组织样品进行免疫荧光验证星形胶质细胞中是否存在HCAR1。2.通过CCK-8实验检测在生理浓度0-20mM浓度的L-乳酸对星形胶质细胞的最佳给药浓度。3.通过使用最佳给药浓度的L-乳酸刺激原代星形胶质细胞后,使用R.T.-QPCR的方法检测文献提供的相关因子的表达,确定L-乳酸对星形胶质细胞影响最密切的指标。4.通过CRISPR-Cas9的方法获得HCAR1基因敲除的U87细胞株,并通过L-乳酸刺激细胞株,以及使用SiRNA干扰原代星形胶质细胞的HCAR1的表达,再给予L-乳酸的刺激,最后通过Western Blotting的方法检测Arc的表达是否与HCAR1有关。5.在体外培养的原代星形胶质细胞、β-arrestin1敲除、β-arrestin2敲除、转染β-arrestin2过表达质粒的细胞中分别给予L-乳酸刺激后,通过Western Blotting的方法检测Arc的表达是否与Gi蛋白和β-arrestin有关。6.通过对星形胶质细胞使用MAPK抑制剂PD98050和SB203580验证L-乳酸刺激下Arc的表达与MAPK有关。7.通过对星形胶质细胞和HCAR1敲除的细胞株以及β-arrestin2敲除的星形胶质细胞进行谷氨酸损伤刺激后,使用流式细胞术检测对照组、对照+L-乳酸给药组、HCAR1干扰组、HCAR1干扰组+L-乳酸给药组、β-arrestin2敲除组、β-arrestin2敲除+L-乳酸给药组的原代星形胶质细胞中钙离子内流的变化,并通过AV/PI实验验证星形胶质细胞在谷氨酸损伤下L-乳酸对星形胶质细胞是否具有治疗作用以及HCAR1干扰与β-arrestin2敲除对星形胶质细胞保护作用的影响。结果:1.脑中HCAR1广泛存在且星形胶质细胞中表达HCAR1通过对小鼠的各个脑区(皮层、胼胝体、海马、小脑、脉络层)组织切片的免疫组化的结果表明HCAR1在脑内广泛表达,且通过免疫荧光证明星形胶质细胞中存在HCAR12.乳酸引起星形胶质细胞众多营养因子中Arc的显著上调CCK-8实验验证L-乳酸对星形胶质细胞最佳给药浓度为0.5mM,RT-QPCR实验结果发现L-乳酸刺激下使Arc/arg3.1的表达显著上调(P<0.0001),通过Western Blotting实验也验证了乳酸导致Arc的表达增强3.乳酸通过HCAR1引起Arc/arg3.1蛋白表达上调在HCAR1敲除的细胞株中以及转染HCAR1siRNA的原代星形胶质细胞中给予L-乳酸刺激后,Arc的蛋白表达不再增加,表明乳酸通过HCAR1引起Arc蛋白的上调。4.乳酸通过β-arrestin2介导上调Arc/arg3.1,且不通过HCAR1的Gi蛋白途径介导。给予L-乳酸刺激后,β-arrestin2敲除的原代星形胶质细胞中Arc的蛋白表达不再增加,β-arrestin1敲除的原代星形胶质细胞中Arc的蛋白表达依旧增加,并且使用百日咳毒素PTX后,不影响星形胶质细胞中ARC蛋白的表达,表明乳酸不通过HCAR1中的Gi蛋白途径而是可能通过HCAR1/β-arrestin2途径介导上调Arc/arg3.1表达,并且过表达β-arrestin2后,Arc蛋白表达更加显著。5.乳酸通过β-arrestin2-MAPK通路增强MAPK依赖性的Arc/arg3.1表达通过对星形胶质细胞使用MAPK抑制剂PD88059和SB25035后,L-乳酸刺激下Arc蛋白的表达不再增加。6.乳酸通过HCAR1-β-arrestin2途径上调Arc减少谷氨酸损伤导致的星形胶质细胞钙离子内流和细胞凋亡。在谷氨酸损伤情况下,使用细胞流式术检测在L-乳酸刺激下的钙离子探针flour-3AM浓度从而反应钙离子内流的变化,结果表明乳酸可以减少星形胶质细胞钙离子的内流,而HCAR1干扰后以及β-arrestin2敲除后取消了这一现象。通过AV/PI实验结果证明,L-乳酸减少星形胶质细胞在谷氨酸损伤情况下的细胞凋亡,而HCAR1干扰后以及β-arrestin2敲除后同样取消了这一现象。结论:1.乳酸通过HCAR1-β-arrestin2途径增强Arc/arg3.1的表达2.L-乳酸对谷氨酸损伤下星形胶质细胞损伤具有改善作用,减轻谷氨酸损伤情况下的细胞凋亡。综合来看,本实验具有以下创新之处:1.发现乳酸是增强星形胶质细胞Arc蛋白表达的信号分子,这可以减轻星形胶质细胞面对谷氨酸的损伤,对星形胶质细胞具有一定的保护作用。2.提出HCAR1是改善和治疗由谷氨酸引起的神经退行性疾病的重要靶标。