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肌肉卫星细胞是一种在肌肉发育过程中紧贴在骨骼肌细胞表面扁平有突起的肌源性干细胞,是发育生物学研究的重要内容,在发育过程中会融合成多核肌管,最后形成肌纤维。本研究以牛肌肉卫星细胞(Muscle-Derived Satellite Cells,MDSCs)为研究对象,通过体外培养、体外分化、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色等实验技术,检测RanGTPase的激活蛋白RanGAP1(RanGTPase activating protein 1)在牛MDSCs体外分化过程中表达的变化,研究RanGAP1在过表达和低表达时,对MDSCs体外分化过程的影响,探究RanGAP1在MDSCs体外分化过程中与PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的关系,来探讨RanGAP1对牛肌肉卫星细胞分化的影响。具体实验内容及结果如下:(1)RanGAP1表达水平研究:通过牛MDSCs体外分化,收集分化0 d、1 d、2 d、3 d的蛋白样,Western blot结果显示,随着体外分化时间的增加,RanGAP1的蛋白含量逐渐增加,MYOG的蛋白含量也逐渐增加。另外,通过免疫荧光染色分化0 d、1 d、3 d的体外分化的牛MDSCs,发现0 d没有肌管形成,1 d开始出现小型肌管,3 d小型肌管开始融合,形成多核肌管。(2)RanGAP1的过表达:通过CRISPR-dCas9技术构建激活载体vpr+R3。转染24h后,RanGAP1的蛋白含量增加,同时分化标记因子(myogenin,MYOG)的含量也同时增加。免疫荧光染色结果显示,vpr+R3组的肌管融合率明显增高。(3)抑制RanGAP1的表达:通过CRISPR-dCas9技术构建抑制载体dcas9+R3,转染24 h后,RanGAP1蛋白含量降低,同时MYOG的含量也降低。免疫荧光染色结果显示,dcas9+R3组的肌管融合率明显降低。(4)RanGAP1与PI3K/AKT信号通路的关系:牛MDSCs分化培养体系中加入PI3K抑制剂LY294002 24 h后检测,显示抑制剂组RanBP2、RanGAP1和MYOG的蛋白含量都下降。(5)RanGAP1与MAPK/ERK1/2信号通路的关系:牛MDSCs分化培养体系中加入MAPK/ERK抑制剂U0126 24 h后检测,显示抑制剂组RanBP2、RanGAP1和MYOG的含量都没有明显变化。结果表明:RanGAP1促进牛MDSCs分化,在分化过程中受PI3K/AKT信号通路的调控,而不受MAPK/ERK1/2信号通路的影响。