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单糖组成是多糖一级结构研究的重要内容。目前,单糖组成测定方法还存在诸多问题,尤其是酮糖的测定,是单糖组成分析的难点。本文以解决代表性的酮糖——果糖的测定问题为出发点,系统研究了多种单糖组成的HPLC分析方法,并将这些方法应用于含果糖残基的多糖及低聚糖的单糖组成测定。
论文首先采用三种方法对麦冬多糖分子量及其分布进行测定。其中,利用分子排阻色谱联用小角度激光光散射法测得麦冬多糖的重均分子量为3962g·moL-1,该多糖在水相中的构象介于球状和无规卷曲之间。
论文以含果糖残基的麦冬多糖为研究对象,重点研究了适合于麦冬多糖的单糖组成HPLC-ELSD直接测定方法。考察麦冬多糖的全水解条件,以HPLC-ELSD法检测水解产物、GPC法监测水解程度,得到了麦冬多糖的全水解条件为:以3.0mL 0.02mol·L-1TFA于110℃条件下封管水解2h。同时,对麦冬多糖的HPLC-ELSD直接测定法进行方法验证,果糖的平均加样回收率为100.3%,RSD为2.0%;葡萄糖的平均加样回收率为98.1%,RSD为5.0%。麦冬多糖的单糖组成及摩尔比为果糖∶葡萄糖=15∶1。
论文还建立对氨基苯甲酸(p-AMBA)柱前衍生化-HPLC测定法。确定的p-AMBA衍生化条件为乙酸催化、对氨基苯甲酸浓度0.6 mol·L-1、60mg氰基硼氢化钠溶于5mL甲醇溶液中,反应温度70℃、反应时间60min。通过HPLC条件优化,实现了9种常见酮糖、醛糖、糖醛酸衍生物的HPLC分离分析。将该方法应用于麦冬多糖的单糖组成分析中,得到的结果与HPLC-ELSD法一致。
最后,论文还对氨基苯甲酸乙酯(ABEE)柱前衍生化-HPLC测定法进行了研究。确定的衍生化条件为80μL三氟乙酸催化、ABEE与单糖浓度比为72∶1,反应温度70℃、反应时间30min。通过HPLC条件优化,实现了6种常见酮糖、醛糖、糖醛酸衍生物的分离。将该方法应用于含果糖残基的低聚糖——蔗糖和棉籽糖的单糖组成测定,得到的结果与理论值基本一致。
以上研究为多糖的单糖组成测定,以及含果糖残基的多糖药物质量标准的制定提供了方法和依据。