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研究背景大肠癌是我国高发病率的恶性肿瘤之一,近年来发病率有升高趋势,死亡率居高不下。肿瘤的发生多伴随或后继于癌基因/抑癌基因的突变和表达调控的异常,突变包括基因缺失、移码突变和点突变等,表达调控的异常在基因的转录、转录后的剪切及翻译水平都可发生。XAF1是由Liston等首先从酵母双杂交系统中鉴定到的XIAP相关因子,能与XIAP直接结合拮抗其抑制caspase活性而起促进细胞凋亡的作用。近来的研究显示XAF1尚有XIAP非依赖性的促进肿瘤细胞凋亡的作用,并在肿瘤细胞中低表达或不表达,因此被认为是肿瘤抑制基因。目前发现XAF1的mRNA有5种转录(剪切)变异体XAF1A、XAF1B、XAF1C XAF1D和XAF1E;分别编码不同的蛋白,XAF1A的研究较多,有促进肿瘤细胞凋亡的作用。有文献报道XAF1B、XAF1C可能拮抗XAF1A的作用,而Chung等人报道XAF1B、XAF1C、XAF1D、XAF1E和XAF1A一样均起促进细胞凋亡的作用。肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的分化、增殖与凋亡密切相关,因此探讨肿瘤细胞分化、增殖或凋亡相关基因对揭示肿瘤发生机制,探索肿瘤本质及其在肿瘤治疗中具有十分重要的科学意义。全反式维甲酸及干扰素是细胞分化诱导剂,同时全反式维甲酸及干扰素又能诱导XAF1A的表达,XAF1是否参与肿瘤细胞的分化目前尚无报道。研究目的鉴于XAF1多个转录变异体在肿瘤中的作用及其在肿瘤细胞分化中的作用尚不明确,本实验检测XAF1三个转录变异体XAF1A、XAF1B、XAF1C及XAF1A蛋白在胃肠道肿瘤细胞系中及大肠癌及癌前病变中的表达,并通过上调XAF1A在肿瘤细胞中的表达观察XAF1A对肿瘤细胞增殖分化的影响,初步探讨XAF1基因在肿瘤中的可能作用,为阐明大肠癌发生发展机制及肿瘤治疗提供研究资料。材料与方法1材料:胃肠道肿瘤细胞株及正常转化细胞:由本实验保存;临床石蜡组织标本(包括正常、腺瘤、癌组织):本科室的病理室提供;新鲜胃肠道正常、息肉、肿瘤及相应的癌旁组织:南方医院消化内镜中心及手术室收集;pcDNA3.1/XAF1相关质粒及荧光素酶报告基因相关质粒:王继德教授提供。2 XAF1三个转录变异体在胃肠道肿瘤细胞系、大肠癌、癌前病变及经过干扰素诱导后的MGC803细胞中的表达情况检测:RT-PCR;3 XAF1在胃肠道肿瘤细胞株及大肠肿瘤组织中的表达情况检测:Westernblotting;4 XAF1在大肠肿瘤组织、息肉组织及正常组织中的表达情况检测:免疫组织化学染色法;5脂质体XAF1A稳定和瞬时转染SW480细胞系的构建;6上调XAF1A对细胞增殖活性的影响检测:MTT方法;7评估过表达XAF1A对survivin启动子和catenin启动子活性的影响:荧光素酶报告基因检测技术;8过表达XAF1A对胃肠道腺癌分化指标E-cadherin、Villin、Pan-CEA蛋白的影响检测:Western blotting;9统计学处理:应用SPSS11.5软件包处理数据,RT-PCR结果采用x~2检验,Western blotting结果采用单样本t检验,免疫组化结果采用x~2检验,MTT结果采用两样本t检验,以P≤0.05表示差别有统计学意义;荧光素酶报告基因结果采用两样本t检验,以P≤0.10表示差别有统计学意义。结果1 RT-PCR结果显示在胃肠道肿瘤细胞株和正常转化细胞中,XAF1三个转录变异体多不表达或低表达,在2株半悬浮细胞株中,XAF1三个转录变异体均高表达。Western blotting结果显示,肿瘤细胞中XAF1A蛋白水平与其mRNA表达水平相一致,经过干扰素诱导后,XAF1三个转录变异体的表达均升高;2 RT-PCR结果显示在大肠癌及癌旁组织中,XAF1 3个转录变异的阳性表达率的差异均无显著性意义,大肠腺瘤及大肠癌组织中XAF1B、XAF1C的阳性率显著低于正常人肠组织(P＜0.05);3免疫组织化学结果显示,与正常黏膜和增生性息肉组织相比,XAF1在腺瘤及癌组织的胞核表达强度降低(P＜0.05),胞浆表达强度强度增高(P＜0.05),总体表达强度降低(P＜0.05);4 MTT结果显示在不同的血清浓度下(4%、10%)XAF1A都有抑制细胞增殖的作用(P＜0.05);瞬时转染时,XAF1对细胞增殖的抑制作用随着转染质粒剂量的增加而增强,XAF1-AS对细胞增殖的促进作用随着转染质粒剂量的增加而增强;在不同细胞株中(SW1116、SW480)有类似反应;5荧光素酶报告基因检测技术显示XAF1能明显抑制survivin启动子和TCF/catenin启动子活性(P＜0.10);6上调XAF1A蛋白的表达对肠癌细胞分化指标E-cadherin、Villin、Pan-CEA蛋白表达无明显的影响。结论1 XAF1三种转录变异体在肿瘤细胞株及正常转化细胞株中均低表达或不表达;2 XAF1A在肿瘤中的表达与正常组织中表达无明显差异,XAF1B和XAF1C的表达紊乱可能影响XAF1A的功能;3 XAF1在正常细胞中主要表达于细胞核,而在肿瘤细胞中主要表达于细胞浆,XAF1在细胞中的定位不同影响其作用;4 XAF1A抑制肿瘤细胞的增殖;5 XAF1A抑制survivin和β-catenin的表达;6 XAF1三种转录变异体均可被干扰素诱导表达,XAF1A可能不影响肿瘤细胞分化。