大鲵三株细胞系的建立及黏液与血清蛋白图谱分析

来源 :中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:papalong2009
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中国大鲵(Chinese giant salamander, Andrias davidianus)是我国的特有物种,也是世界现存个体最大的两栖动物,具有重要的经济和科研价值。但蛙病毒引起的大鲵流行性疾病造成很高的死亡率,对大鲵养殖业危害严重,还威胁到大鲵野生种群。本论文建立了三株大鲵细胞系,测定了他们对大鲵蛙病毒野生株(Andria davidianus ranavirus,ADRV)和沼泽绿牛蛙病毒重组株(RecombinantRana grylio virus,rRGV)的敏感性。此外,还对正常与蛙病毒感染大鲵的黏液和血清蛋白图谱进行了初步分析和比较。主要结果如下:  1.大鲵三株细胞系的建立及对两种蛙病毒的敏感性:通过原代和传代培养,建立了大鲵胸腺细胞系(GSTC),脾脏细胞系(GSSC)和肾脏细胞系(GSKC)。三种细胞都呈上皮状,在含10% FBS的M199培养基25℃条件下培养生长良好。染色体核型分析显示GSTC染色体众数是2n=50。GSTC细胞感染ADRV后,在6 hpi可以检测病毒MCP的转录,并在24 hpi观察到CPE。三种细胞系都对ADRV敏感,但在感染ADRV的GSTC细胞中CPE出现的时间最早,细胞病变最严重,且产生的病毒滴度最高(108.4 TCID50/mL),表明GSTC细胞对ADRV最敏感。制备感染ADRV的GSTC细胞超薄切片,电镜观察到病毒加工厂和结晶状排列的病毒粒子。感染rRGV的GSTC细胞不仅形成噬斑,还能发射绿色荧光。这些数据显示GSTC对野生型蛙病毒ADRV和重组型蛙病毒rRGV都敏感,大鲵三株细胞系将为ADRV的研究提供有用的工具。  2.正常与蛙病毒感染大鲵的黏液和血清蛋白图谱分析:通过SDS-PAGE辅以光密度分析对正常大鲵的黏液和血清,自然感染大鲵的黏液和血清以及人工感染ADRV的大鲵黏液和血清蛋白图谱分别进行了分析比较。结果显示:血清蛋白带大量集中在分子量80-60 kDa区域,其含量约占总蛋白量的45%,此外正常大鲵血清在14-57 kDa之间还有16条蛋白带:57,53,50,43,40,38,36,31,27,26,25,22,16,15.5,15和14 kDa。正常对照与感染大鲵血清比较有4条差异蛋白带:53,33,22和16 kDa。正常和感染的大鲵黏液都含有11条主要的蛋白带:116,100,75,57,53,45,27,18,17,16和15 kDa,但感染大鲵的黏液多出90,52,43,32,26,20和13 kDa这7条蛋白带。还有些蛋白带含量出现变化,如45 kDa条带在正常黏液中占总蛋白量的19.3%,而在人工感染黏液中仅占总蛋白的3.8%。本研究证实蛙病毒感染能导致大鲵黏液和血清蛋白图谱发生变化,也为深入探寻两栖类抗病毒相关的蛋白生物标记提供了有价值的信息。
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