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研究背景:胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤,在因恶性肿瘤引起死亡里排第七位,是消化道恶性肿瘤死亡的第二大原因。根据2012年全球癌症统计数据,在年龄标准化的人群中,每10万人的发病率和死亡率分别为5.9和5.5。胰腺癌手术治疗效果不理想,术后5年生存率低于5%。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族的成员之一,可以诱导多种肿瘤细胞的凋亡,而不会引起正常细胞的凋亡。因此,它被认为是一种潜在的具治疗作用的抗癌药物。然而,最近的研究显示,许多恶性肿瘤对TRAIL具有耐药性,这将成为该药物临床应用的瓶颈。雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是从雷公藤中分离得到的一种独特的二萜结构形式。TPL在体内和体外均具有良好的抗肿瘤活性。我们前期的研究表明,低浓度TRAIL和TPL联合治疗胰腺癌细胞,通过增加胰腺癌细胞凋亡率,导致细胞死亡。但是,现有的研究对完全理解TPL在胰腺癌中致敏TRAIL的机制还远远不够。目的:寻找TPL调控的TRAIL信号通路上游成分,进一步了解TPL提高TRAIL敏感性的调控机制。同时,进一步了解胰腺癌细胞发生发展过程中的重要分子机制。研究方法:采用CCK-8、Celigo贴壁细胞计数系统检测细胞增殖水平;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞的蛋白表达水平;采用免疫组化法(IHC)检测组织中蛋白的表达水平;采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测蛋白的相互结合;采用投射电镜观察自噬小体;采用Transwell检测细胞迁移、侵袭水平;采用流式细胞仪(Flowcytometry)检测细胞凋亡;裸鼠皮下成瘤检测肿瘤细胞体内生长能力;裸鼠肺转移实验检测肿瘤的体内侵袭转移能力。研究内容和结果:本研究分为两个部分:第一部分:雷公藤甲素(Triptolide,TPL)通过抑制PUM1的表达水平增加胰腺癌细胞对TRAIL的敏感性的机制研究1.PUM1是胰腺癌细胞中TPL增强TRAIL敏感性的关键因子。基因芯片分析TPL、TRAIL、TPL+TRAIL(T+T)分别处理MIA PaCa-2细胞株的mRNA。采用公式:基因集I(TPL vs DMSO)+基因集II(TPL+TRAIL vs DMSO)-基因集III(TRAIL vs DMSO)确定了TPL可能致敏的TRAIL的23个靶点。分别敲降23个靶基因,Celigo结果表明,在低浓度TRAIL的条件下,相比对照组,敲降PUM1基因对抑制细胞生长的作用最为明显。因此,PUM1可能是TPL增强TRAIL敏感性的关键因子。2.在低浓度TRAIL作用下胰腺癌细胞中PUM1的表达水平对细胞增殖、凋亡的影响。在低浓度TRAIL作用下胰腺癌细胞中,敲降PUM1可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,同时促进凋亡相关蛋白cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的表达上调。相反的,在低浓度TRAIL处理过胰腺癌细胞中,过表达PUM1可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,同时抑制凋亡相关蛋白cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的表达。裸鼠成瘤实验也证明在低浓度TRAIL处理过胰腺癌细胞中,shPUM1组肿瘤体积较对照组明显减小。3.敲降PUM1可以通过抑制胰腺癌细胞G1-S期转变,增强TRAIL的敏感性。低浓度TRAIL处理过的细胞周期实验发现shPUM1可以抑制胰腺癌细胞G1-S期的转化,Western Blot发现p27和p27-CDK2复合物的表达量都显著增加,cyclin A和cyclin E的表达水平显著降低。4.TPL通过下调PUM1,促进胰腺癌细胞自噬,增强TRAIL的敏感性。透射电子显微镜发现相比TRAIL组,TPL+TRAIL组自噬小体数量增加,Western Blot发现胰腺癌细胞中ATG5、ULK1、VPS34的表达增加,mTOR表达减少,意味着TPL+TRAIL可以促进胰腺癌细胞的自噬。同时我们发现,TRAIL处理后,shPUM1组也可以促进胰腺癌细胞自噬,且过表达PUM1可以部分逆转TPL对TRAIL自噬的促进作用。用3-MA抑制自噬后,可以部分逆转在低浓度TRAIL处理后敲降PUM1对胰腺癌细胞增殖的抑制和凋亡的促进。第二部分:PUM1在胰腺癌中作用的机制研究1.PUM1蛋白的高表达预示着患者预后不良。GEPIA生物信息学分析提示肿瘤组织PUM1的mRNA表达高于癌旁组织,免疫组化分析组织芯片提示胰腺癌患者肿瘤中PUM1的蛋白表达水平高于癌旁组织。同时,PUM1蛋白的表达水平与患者TMN分期相关,PUM1蛋白高表达的患者总体生存时间较短(P<0.05)。2.抑制PUM1的表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT),促进其凋亡。体外MTS实验证明敲降PUM1可以抑制细胞增殖,Transwell实验证明敲降PUM1可以抑制细胞迁移、侵袭,流式实验证明敲降PUM1可以促进细胞凋亡,Western Blot发现敲降PUM1可以抑制MMP9、VEGF、vimentin的表达,促进E-cadherin的表达。相反的,过表达PUM1可以促进细胞增殖、迁移、侵袭、EMT,抑制凋亡。体内裸鼠皮下成瘤实验证明敲降PUM1可以抑制皮下肿瘤的生长,肺癌转移模型证明敲降PUM1可以减少PUM1肺组织中ki67阳性细胞的数量。3.PUM1通过抑制PERK/eIF2/ATF4信号通路促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT,抑制其凋亡。IPA分析发现PUM1的敲降可以激活eIF2信号通路,Western Blot证明PUM1敲降促进p-PERK、p-EIF2A、ATF4的表达,组织芯片相关性分析证明PUM1的表达水平与p-PERK的表达呈负相关。在胰腺癌细胞中过表达PERK后,MTS实验发现细胞增殖抑制,Transwell实验发现细胞迁移、侵袭抑制,流式实验发现细胞凋亡促进,Western Blot发现MMP9、VEGF、vimentin的表达降低,E-cadherin的表达增加。在PUM1敲降的胰腺癌细胞中使用PERK的抑制剂可以部分逆转PUM1对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、凋亡的影响。结论:1.敲降PUM1在体内和体外都可以提高胰腺癌细胞对TRAIL的敏感性,这提示PUM1可能成为提高胰腺癌细胞对TRAIL敏感性的新靶点。我们的结果表明,TPL通过下调PUM1来激活自噬,从而提高胰腺癌细胞的TRAIL敏感性。2.PUM1的下调可以通过PERK/eIF2/ATF4信号通路,抑制胰腺癌细胞的生长、侵袭、迁移、EMT,促进细胞的凋亡。