论文部分内容阅读
目的:通过检测套细胞淋巴瘤（MCL）患者病理组织标本和MCL细胞株中miR-100和mTOR的表达,研究miR-100和mTOR在套细胞淋巴瘤细胞中的生物学功能,并探讨miR-100通过靶向调控mTOR的表达而抑制套细胞淋巴瘤生长的机制,为套细胞淋巴瘤的治疗提供新的靶点。方法:1、收集我院2016年9月～2018年12月病理诊断为套细胞淋巴瘤及增生性淋巴结炎患者的病理组织标本各18例。采用RT-PCR方法检测病理组织中miR-100 mRNA的表达水平,卡方检验分析MCL病理标本中miR-100 mRNA的表达与患者临床及病理资料的关系;采用western blot方法检测病理组织中mTOR蛋白的表达水平,应用线性拟合方法研究MCL患者病理标本miR-100 mRNA与mTOR蛋白的相关关系。2、采用RT-PCR方法检测3株套细胞淋巴瘤细胞系（Jeko-1、Mino、Granta-519）和正常淋巴细胞中miR-100和mTOR mRNA的表达水平,应用线性拟合方法研究MCL细胞株中miR-100与mTOR的相关关系。3、筛选出最佳沉默mTOR基因的干扰片段,并通过构建过表达miR-100的慢病毒和最佳mTOR干扰片段的慢病毒,转染Jeko-1和Mino细胞,采用RT-PCR方法分别检测过表达miR-100及干扰mTOR后miR-100及mTOR mRNA水平的变化。4、应用CCK-8法分别观察过表达miR-100或干扰mTOR后对Jeko-1和Mino细胞株细胞增殖的影响;流式细胞术检测过表达miR-100或干扰mTOR后对Jeko-1和Mino细胞株细胞凋亡及细胞周期G1、G2、S指数的影响。5、生物信息预测软件预测miR-100可以靶向mTOR基因以及mTOR mRNA转录本与miR-100的互补结合区,再构建mTOR野生型和突变型的荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶实验进行靶基因验证miR-100与mTOR-3’UTR靶向结合。6、RT-PCR方法检测过表达miR-100后mTOR基因mRNA水平的变化,western blot检测过表达miR-100和干扰mTOR后mTOR蛋白水平的变化。7、在上调miR-100表达的基础上进行mTOR恢复表达实验,将miR-100过表达慢病毒载体和mTOR过表达质粒共转染Jeko-1和Mino细胞株,检测对mTOR mRNA和蛋白水平的影响以及对细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响,进一步验证miR-100在套细胞淋巴瘤中靶向调控mTOR抑制套细胞淋巴瘤的生长。结果:1.与增生性淋巴结炎相比,套细胞淋巴瘤患者病理组织中miR-100的mRNA水平明显的低表达（p<0.0001）,表达水平与其临床LDH水平和IPI评分有关,p<0.05。与患者年龄、性别、结外器官累及数、有无B症状、临床分期、肿瘤大小、骨髓浸润、合并白血病、Ki67等指标无关;套细胞淋巴瘤患者病理组织中mTOR的蛋白水平明显高表达（p=0.003）;表达与miR-100 mRNA的表达呈负相关（r=-0.9161,p<0.0001）。2.与正常淋巴细胞相比,三个套细胞淋巴瘤细胞株（Jeko-1、Mino、Granta-519）中miR-100 mRNA的表达水平较低（p<0.0001）,mTOR mRNA的表达水平较高（p<0.0001）,表达水平呈负相关（r=-0.9927,p<0.0001）。3.LV-miR-up能高效转染Jeko-1和Mino细胞,转染后可上调miR-100 mRNA的表达水平;LV-mTOR-RNAi能高效转染Jeko-1和Mino细胞,转染后可下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达水平;LV-miR-up和LV-mTOR-RNAi均能抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并使细胞周期阻滞在G1期,与对照组相比,差异均存在统计学意义。4.miRanda、Target Scan、Pic Tar三个生物信息分析软件共同预测了miR-100是靶向mTOR基因的miRNA以及mTOR mRNA转录本与miR-100的互补结合区在295-301位点。双荧光素酶实验结果表明miR-100过表达质粒可以抑制野生型3’UTR的mTOR报告质粒的luciferase的表达（p<0.0001）,不能抑制突变型3’UTR的mTOR报告质粒的luciferase的表达,验证了miR-100可与mTOR-3’UTR靶向结合。5.套细胞淋巴瘤细胞株过表达miR-100后可以下调mTOR的mRNA和蛋白的表达水平,通过mTOR过表达后可部分抵消过表达miR-100对mTOR基因的mRNA和蛋白的抑制,从而部分抵消过表达miR-100后抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及阻滞周期停滞于G1期的作用,且差异均有统计学意义。结论:1、在MCL病理标本及细胞系中miR-100低表达,mTOR高表达,两者呈负相关关系。2、在体外分别上调miR-100和下调mTOR后均可抑制MCL细胞增殖、诱导MCL细胞凋亡并可将MCL细胞的周期阻滞于G1期,miR-100可能是一个抑癌基因,mTOR可能是一个癌基因。3、miR-100通过靶向调控mTOR的表达抑制套细胞淋巴瘤生长而发挥肿瘤的效应。