研究背景:随着发病率的迅速提高,糖尿病已成为当今社会危害人类健康的最主要疾病之一,而胰岛β细胞的数目减少是导致糖尿病发病的主要原因。因此,抑制胰岛β细胞的损伤凋亡并促进其增殖成为治疗糖尿病的关键手段之一。硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是目前唯一已知的可以通过其247位的半胱氨酸与还原型硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的半胱氨酸结合,并抑制其活性的物质进而介导氧化应激、诱导细胞凋亡等作用。已有研究证实,在糖尿病的发生发展过程中,TXNIP的表达显著上调,且可以诱导胰岛β细胞凋亡。同时,有研究表明在诸多肿瘤组织中TXNIP表达明显下降,增加TXNIP表达可以抑制肿瘤的生长,提示TXNIP与细胞增殖也存在密切关系,但其对胰岛β细胞增殖的影响尚不清楚。与Trx结合是TXNIP发挥作用的主要途径。但也有研究表明,在皮肤成纤维细胞中,TXNIP可以抑制葡萄糖的摄取,而这种作用与Trx无关。在脂肪细胞中,使用第247位的半胱氨酸突变的TXNIP同样抑制了脂肪细胞葡萄糖的摄取,证明这种效应与其抑制Trx的作用无关,提示TXNIP还存在非依赖Trx系统的作用机制,那么,TXNIP对胰岛β细胞增殖影响的途径又如何?据此我们设计了本实验,首先选取了当前比较主流的两种腺病毒感染细胞的方法,并且比较这两种方法中哪种更适合在INS-1细胞中构建TXNIP过表达模型。在确定腺病毒感染方法后,利用此技术将TXNIP过表达和半胱氨酸247点位突变的TXNIP过表达后的两种腺病毒载体分别感染进入细胞,在正常条件下培养并且设置对照组,来探究TXNIP依赖和非依赖Trx途径对INS-1胰岛β细胞增殖的影响及可能的机制。第一部分:两种腺病毒感染方法在INS-1胰岛β细胞中构建TXNIP过表达模型的比较目的:在大鼠INS-1胰岛β细胞中,通过比较相同腺病毒载体介导的不同感染细胞的方法以寻找一种更加稳定而高效的TXNIP过表达模型。方法:1.构建含有绿色荧光蛋白(GFP)的空腺病毒载体(Ad-GFP)和TXNIP过表达腺病毒载体(Ad-TXNIP-GFP)。2.根据感染复数50,计算不同组的病毒量然后感染正常培养条件下的INS-1细胞。方法I中的正常组(Normal)直接加入1mL 1640培养基,空病毒组(Ad-GFP)和TXNIP过表达组(Ad-TXNIP-GFP)各加入1mL对应的腺病毒与1640培养基的混合液。方法I在腺病毒感染4h后补3mL 1640完全培养基,培养到24h后更换培养基,再继续培养到48h;方法Ⅱ中的正常组(Normal)直接加入1mL 1640培养基,空病毒组(Ad-GFP)和TXNIP过表达组(Ad-TXNIP-GFP)各加入1mL对应的腺病毒与1640培养基的混合液,在腺病毒感染4h后用PBS洗去含有腺病毒的1640培养基,更换4mL完全培养基培养到48h,中间不做任何处理。3.荧光显微镜下观察各组GFP表达情况。4.流式细胞术检测各组GFP阳性率和平均荧光强度。5.CCK-8检测各组INS-1细胞存活率。6.Real-time PCR检测TXNIP在mRNA的表达水平。7.Western blot检测TXNIP在蛋白质的表达水平。结果:1.方法Ⅱ的腺病毒感染INS-1细胞的效率高于方法I荧光显微镜可见方法I在48h时空病毒组和TXNIP过表达组的GFP表达情况均低于方法Ⅱ(P<0.05)。流式细胞术检测可知,方法I中空病毒组和TXNIP过表达组的GFP阳性率和平均荧光强度均低于方法Ⅱ中空病毒组和TXNIP过表达组,方法Ⅱ中空病毒组的腺病毒感染效率提高12.06%,方法Ⅱ中TXNIP过表达组的腺病毒感染效率提高12.35%(n=6,P<0.05)。2.方法Ⅱ的INS-1细胞存活率高于方法I由CCK-8检测结果可知,方法Ⅱ中空病毒组的细胞存活率比方法I中空病毒组提高26%(n=6,P<0.05),方法Ⅱ中TXNIP过表达组的细胞存活率比方法I中TXNIP过表达组提高13%(n=6,P<0.05),两种方法的正常组细胞存活率接近(n=6,P>0.05)。3.方法Ⅱ的TXNIP在INS-1细胞中的表达高于方法IReal-time PCR检测结果显示,方法Ⅱ中TXNIP过表达组的TXNIP表达水平明显高于方法I中的TXNIP过表达组(n=6,P<0.05)。Western blot检测结果显示,方法Ⅱ中TXNIP过表达组TXNIP基因在蛋白水平的表达明显高于方法I中的TXNIP过表达组(n=6,P<0.05)。结论:1.在INS-1胰岛β细胞中使用方法Ⅱ进行腺病毒感染,感染效率更高且对细胞本身存活率的负面影响更小。2.方法Ⅱ中目的基因TXNIP在细胞中的表达程度更高,TXNIP过表达模型的建立更加稳定和高效,更有利于后续实验的进行。第二部分:使用腺病毒过表达TXNIP对INS-1胰岛β细胞增殖的影响目的:1.探究TXNIP单纯过表达后,在正常培养条件下,对INS-1细胞增殖的影响及可能的机制。2.探究TXNIP过表达后,其半胱氨酸247点位突变后,TXNIP非依赖Trx途径对INS-1胰岛细胞增殖的影响及可能的机制。方法:1.实验分组:将正常培养条件下的INS-1细胞分为四组,正常对照组(Normal);空病毒组(Ad-GFP);TXNIP过表达组(Ad-TXNIP-GFP);TXNIP过表达后半胱氨酸247点位突变组(Ad-TXNIPc247s-GFP)。2.腺病毒感染技术,将各组计算好的腺病毒与1mL1640培养基混合后加入正常培养条件下的INS-1细胞的培养瓶中,正常组加入不含病毒的1mL1640培养基,其余三组加入1 mL各自对应病毒的1640培养基混合液,然后放入培养箱培养到24h后,用PBS洗去旧培养基,然后更换4 mL1640完全培养基,再继续培养到48h。3.流式细胞术检测腺病毒感染细胞后GFP的阳性率和平均荧光强度,EdU和Ki67标记INS-1细胞后的增殖情况。4.Real-time PCR检测腺病毒感染细胞后,TXNIP在mRNA水平的表达情况。5.Western blot检测TXNIP、AKT、P-AKT、ERK、P-ERK、β-Catenin、P-β-Catenin、Ki67在蛋白水平的表达。结果:1.确定腺病毒的最佳感染条件通过流式细胞术,分别检测了不同腺病毒感染时间24h、48h、72h和不同腺病毒感染复数25、50、75、100下GFP的阳性率和GFP平均荧光强度。结果显示,当感染时间为48h,感染复数为75,GFP的阳性率和平均荧光强度最高。所以,我们以此为腺病毒感染的最佳条件进行后续实验。2.腺病毒感染INS-1细胞后TXNIP的表达明显提高由Real-time PCR检测TXNIP在mRNA水平的表达情况可知,Ad-TXNIP-GFP组和Ad-TXNIPc247s-GFP组的TXNIP表达水平明显高于Normal组(n=6,P<0.01)。Western blot检测TXNIP在蛋白水平的表达情况可知,Ad-TXNIP-GFP组和Ad-TXNIPc247s-GFP组中TXNIP的表达明显高于Normal组(n=6,P<0.05)。结果表明,腺病毒载体构建成功,腺病毒感染INS-1细胞成功,TXNIP过表达模型建立符合实验要求。3.TXNIP过表达后可以从依赖Trx和非依赖Trx两种途径抑制INS-1细胞增殖由EDU检测细胞增殖结果可知,与Normal组相比,Ad-GFP组的增殖情况无明显差异,Ad-TXNIP-GFP组和Ad-TXNIPc247s-GFP组明显抑制细胞增殖(n=6,P<0.05),且Ad-TXNIP-GFP组对细胞的抑制情况要高于Ad-TXNIPc247s-GFP组(n=6,P<0.05)。由Ki67检测细胞增殖结果可知,Normal组与Ad-GFP组无明显差异(n=6,P>0.05),与Normal组相比,Ad-TXNIP-GFP组和Ad-TXNIPc247s-GFP组明显抑制细胞增殖(n=6,P<0.05),且Ad-TXNIP-GFP组对细胞的抑制情况仍然要高于Ad-TXNIPc247s-GFP组(n=6,P<0.05)。由结果可知,TXNIP过表达后依赖Trx途径和非依赖Trx途径都可以抑制INS-1细胞增殖,且依赖Trx途径对细胞增殖的抑制程度高于非依赖Trx途径。4.TXNIP可以通过非依赖Trx途径抑制AKT、ERK的磷酸化由Western blot检测AKT、P-AKT、ERK、P-ERK结果可知,与Normal组相比,Ad-GFP组无明显差异,Ad-TXNIP-GFP组和Ad-TXNIPc247s-GFP组都抑制了AKT和ERK的磷酸化(n=6,P<0.05)。β-catenin以及P-β-catenin检测结果显示四组无明显差异(n=6,P>0.05)。结果表明TXNIP过表达后通过非依赖Trx途径抑制AKT,ERK的磷酸化,而β-catenin没有参与到TXNIP对细胞增殖的调控中。5.抑制AKT、ERK的磷酸化可以抑制INS-1细胞的增殖我们在Normal组和Ad-GFP组中分别加入了10μmol/L AKT磷酸化抑制剂Perifosine和20μmol/L ERK磷酸化抑制剂PD98059。由Western blot检测结果可知,与Normal组相比,Ad-GFP组无明显差异,Normal+Perifosine组、Ad-GFP+Perifosine组、Ad-TXNIP-GFP组、Ad-TXNIPc247s-GFP组的AKT磷酸化和Ki67增殖相关蛋白的表达受到了明显抑制(n=6,P<0.01),且Ad-TXNIP-GFP组对Ki67的抑制程度高于Ad-TXNIPc247s-GFP组。同样与Normal组相比,Normal+PD98059组、Ad-GFP+PD98059组、Ad-TXNIP-GFP组、Ad-TXNIPc247s-GFP组的ERK磷酸化和Ki67增殖相关蛋白表达也受到了明显的抑制(n=6,P<0.01)。结论:1.TXNIP可以通过依赖Trx途径和非依赖Trx途径抑制INS-1胰岛β细胞的增殖,且依赖Trx途径对细胞增殖的抑制程度更高。2.TXNIP非依赖Trx途径可以通过抑制AKT和ERK的磷酸化来抑制INS-1细胞的增殖。