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肺癌是当今世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,尽管采用了手术、放疗和化疗等综合治疗措施,但疗效不佳。其中一个重要原因是肿瘤组织抗凋亡相关基因表达上调,癌细胞凋亡减少,癌细胞整体耐药增加。很多研究表明,通过反义核酸技术抑制肿瘤抗凋亡基因表达,选择性诱导细胞凋亡,对于有效的清除肿瘤细胞具有重要意义,是肿瘤基因治疗的一项重要策略。然而,诱导凋亡的靶向性差和特异性低是目前限制其疗效的两个重要因素。选择肿瘤细胞特异表达基因并特异的抑制其表达,是靶向诱导肿瘤凋亡的关键。RNA干扰(RNAi)技术是近几年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法,它具有高效率、高特异性、显效快、可以向子代遗传和可同时进行多基因研究等优点,可望作为反义核酸的优化方式成为肿瘤基因治疗的新手段。Survivin是最近发现的一种新的IAPS家族蛋白,是迄今发现的最小的IAPs蛋白,也是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子。由于其表达的特异性(仅在人类胚胎组织和肿瘤组织中表达)及对细胞增殖和凋亡的双重作用,使其成为肺癌基因治疗研究的理想靶目标。因此,通过应用RNA干扰技术抑制survivin基因的表达,观察分析其对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,推断其与肺癌发生、发展、治疗及预后的关系,对指导肺癌的基因治疗有重要意义。研究目的1.研究应用RNA干扰技术抑制survivin基因的表达对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,推断其与肺癌发生、发展、治疗及预后的关系。2.通过比较几种特异的小干涉RNA(siRNA)在诱导肺腺癌A549细胞凋亡的效果,筛选有效的特异的小干涉RNA,获得针对肺腺癌细胞Survivin mRNA和蛋白表达的最佳siRNA靶序列。研究内容和方法研究内容:不同siRNA抑制肺腺癌细胞survivin表达对A549细胞凋亡和增殖的影响,筛选有效的特异siRNA,观察其抑制肺腺癌细胞survivin mRNA和蛋白质表达的效率.研究方法:根据survivin编码框采用生物信息学,由上海吉玛制药有限公司设计、合成3组siRNA相关基因片段和1组FAM标记的阴性对照SiRNA片段,序列经BLAST查询,确定为survivin特异性序列,排除与其他基因同源。脂质体转染法基因转染A549细胞,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测各组细胞的细胞存活率,流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡指数,筛选出特异有效的siRNA进行RT-PCR和western blot法观察其阻断survivin表达对肺腺癌细胞survivin mRNA和蛋白质表达的抑制效率.结果;siRNA通过脂质体转染A549细胞,转染效率可以达到30%左右,荧光倒置显微镜下,FAM标记的阴性对照组细胞呈现黄绿色透亮的细胞,细胞碎片增多。MTT法显示3组siRNA对A549细胞增殖有抑制作用,抑制率明显高于其他组。于转染48h后收集细胞检测细胞周期和凋亡,结果显示3组siRNA转染组细胞明显被阻滞于G2/M期,3组siRNA转染组细胞凋亡率明显高于其他3组。结合MTT法结果综合比较3组siRNA,可见siRNA164转染细胞被阻滞于G2/M期较其它2组更明显,细胞凋亡率也比其它2组高,该组siRNA较其它2组对survivin基因抑制作用更强,诱导细胞凋亡效果更好,因此选定siRNA164组siRNA继续后续western blot试验和RT-PCR试验. western blot可见siRNA164转染组survivin蛋白表达下调,蛋白条带的灰度低于其余各组,统计学分析差异有显著性。RT-PCR试验显示siRNA164组作用于A549细胞48h后survivin mRNA表达明显下调,Survivin mRNA表达的条带亮度低于其余各组,而空白对照组、脂质体组和阴性对照组survivin mRNA水平无明显变化。结论:本研究成功构建了3组针对survivin基因的siRNA序列,并通过脂质体导人肺腺癌A549细胞,观测其对细胞Survivin表达及细胞增殖、凋亡的影响。MTT法显示3组siRNA对A549细胞增殖有抑制作用,抑制率明显高于其他组。流式细胞术检测可以发现,3组序列均可以不同程度阻滞A549细胞于G2/M期,诱导细胞凋亡,3组比较可以发现siRNA 164对survivin基因的抑制作用更强,成功筛选出siRNA164为最佳序列。RT-PCR及western blot结果显示,siRNA转染可显著抑制Survivin mRNA及蛋白的表达,证实了应用RNA干扰技术抑制Survivin表达的可行性。因此,本实验针对survivin构建的siRNA,能有效封闭survivin的表达,抑制A549细胞增殖并诱导细胞凋亡,提示RNA干扰可用于特异性阻断survivin表达,这提示基于survivin的RNAi技术靶向诱导癌细胞凋亡可望成为包括肺癌在内很多恶性肿瘤基因诊断和治疗的新靶点。