隔离子/边界元件(insulator/boundary element)是一类特殊的顺式作用元件,在染色质结构的区域化中起重要作用.其功能定义体现在:(1)当被置于增强子或沉默子与启动子之间时,它能阻断这些调控元件与启动子间的相互作用,即阻断作用(enhancer/silencer blocking).(2)当被置于基因或基因座两侧时,它能保护其免受两侧染色质微环境的正性或负性影响,即克服位置效应(position effect protection).近来已在多种真核生物基因组中发现有隔离子序列,它们在DNA序列、特异性结合蛋白等方面有很大不同,可能发挥多种功能,具有不同的作用机制,表明这类调控元件在进化过程中保守,提示其在基因表达调控网络中具有重要作用.在脊椎动物基因组中第一个被发现的隔离子序列是位于鸡β-珠蛋白基因簇5端的DNase Ⅰ高敏位点4(cHS4).它既可以有效阻断增强子对启动子的激活作用,又可以克服染色体位置效应;而且二者的功能可以分离.单一的CTCF位点即可有效阻断增强子与启动子间的相互作用;但对于克服位置效应而言,似乎并不必要.CTCF位点也存在于鸡β-珠蛋白基因簇3末端的组成型高敏位点(3HS).在脊椎动物,β-珠蛋白基因簇在结构和功能上均高度保守.本研究利用互为反向的Loxp511位点,在MEL细胞基因组的特定位点进行靶载体和交换载体的交换.构建靶载体pβ-EGFP-Neo,电穿孔转染MEL细胞,在Hygromycin选择性半固体培养基中培养并挑取Hygromycin细胞单克降,PCR和Southern blot鉴定整合完整性和拷贝数,获得三株单拷贝完整整合的Hygromycin单克隆细胞株A,B和D.基于已有的成环模型,我们提出如下"成环前模型(pre-looping model)",解释人β-珠蛋白基因簇远端DNase Ⅰ高敏位点的功能和调控机制.Cre重组酶介导的盒交换效率受到一些因素影响,包括交换片段与靶片段的相对长度,交换方向以及Cre重组酶的表达水平等.通过重组腺病毒表达Cre重组酶,是一种提高Cre表达水平和盒交换效率的方法.2.6kb的人5HS5片段含有除CTCF之外的多个转录因子的结合位点,在不同的Hygromycin细胞株中研究不同转录因子与隔离子功能的关系,将有助于深入理解β-珠蛋白基因簇ACH的形成和作用机制.