花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的经济作物和油料作物。由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染花生引起的青枯病(Bacterial Wilt)是影响热带、亚热带以及部分温带地区花生生长的重要细菌性病害;在我国尤以长江流域以及南方地区较为严重。作为一种土传性病害,花生青枯病目前尚没有有效的化学防治手段,与其他作物轮作、间套作及利用生物防治等防治效果也非常有限,因此防治花生青枯病的根本手段还是培育抗病品种。但是由于缺少优良的抗病基因源、抗性表现受环境影响较大以及青枯菌菌系分化的复杂性等,都严重影响了花生抗病育种进程。由于青枯雷尔氏菌复杂的多态性、田间鉴定结果的不稳定性,因此寻求快速、简便、准确而不受时间限制的室内接种鉴定方法则显得非常重要。目前国内外对花生青枯病的研究不多,控制花生对青枯病抗性的基因种类和数量以及它们的表达调控机制还不清楚,花生抗青枯病的分子生物学研究基础还比较薄弱。本研究建立了简便快速的花生青枯病的抗性鉴定方法,构建了受青枯菌诱导的花生根全长cDNA文库,也构建了携带拟南芥抗青枯病基因RRS1的表达载体,为了解花生青枯菌的侵染和花生抗青枯病机理,奠定前期工作基础。研究结果如下:1.选取不同的花生青枯菌菌株,采用伤根灌菌液法接种中感品种闽花6号,测定菌株的致病力差异,菌株431致病力较强,是理想的接种菌株。通过比较几种不同的侵染方法接种花生,观察了抗感品种的发病情况,确定了较为理想的抗性鉴定方法。伤根灌菌液法虽然能够反映品种的抗性,但是由于菌液接种量大、发病周期较长给实验带来了许多不便;叶腋注射法不能反映品种的抗感性,而且操作繁琐,我们不予采纳;剪叶法接种后25d就能反映出品种的抗性,发病周期短,而且操作性强以及接种量小,是理想方便的接种方法。总之,伤根灌菌液法和剪叶法都能说明品种的抗性,剪叶法优于伤根灌菌液法。2.通过伤根灌菌液法接种抗青枯病品种闽花8号,利用SMART技术构建了受青枯菌诱导的花生根处理和对照全长cDNA混合文库。初级文库滴度为1.902×106cfu/ml,插入率99%,插入片段大小在500～2500bp之间,平均为1200bp;扩增文库滴度为9.68×1011 cfu/ml。从文库中随机挑取24个克隆进行两端测序,经过生物信息学分析45%的序列为预测蛋白,功能未知,这说明花生基因组学研究相对薄弱。随机挑取74个克隆进行两端测序,利用BLAST2GO软件进行注释和功能分析。序列经注释后功能分析将已知功能的EST按照细胞组分、分子功能和参与生物过程分为三大类,在细胞组分一类中,大多数被归类为线粒体(mitochondrion)和细胞质膜(plasma membrane)两类;在分子功能的分类中,结合(binding)和催化活性(catalytic activity)居多;在生物过程的分类中,分为代谢过程(metabolic process)和细胞过程(cellular process)的比较多。物种相似性分布分析与水稻、葡萄、拟南芥较为相似,说明花生上仍有大量的待发掘功能基因。3.根据已经登录的RRS1-R基因序列设计引物,通过RT-PCR从拟南芥Nd-1中克隆得到4137bp的抗青枯病基因RRS1-R,与GenBank上登录的原序列同源性达99%,将该基因片断连入植物表达载体pSC1301,构建带抗青枯病基因的植物表达载体pSC1301-RRS1,转化农杆菌EHA105。然后准备对烟草进行了遗传转化进而进行功能验证,后续工作正在进行中。本项目还同时开展了花生对青枯病的抗性遗传和抗性基因克隆研究。上述研究为克隆和深入研究花生抗青枯病的分子机理,提供了前期的工作基础。