研究背景淋巴瘤是原发于淋巴造血组织的恶性肿瘤,随着人类生存环境的不断恶化及人们生活工作压力的不断上升,近年来淋巴瘤的发病率逐年升高。越来越多的研究表明肿瘤的发生是由于正常细胞分化紊乱或分化阻滞的结果。诱导分化治疗是未来肿瘤治疗的一个新的发展方向,B细胞淋巴瘤是研究诱导分化的非常好的模式肿瘤,因为该系统肿瘤的发生是由于淋巴造血细胞分化紊乱或分化阻滞的结果,在淋巴造血细胞发育分化的不同阶段都可以产生相对应类型的肿瘤,并且不同分化阶段的淋巴造血细胞都有其相应的免疫表型及基因特征,便于鉴别和检测。霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤,其包含2个独立疾病：结节性淋巴细胞为主型HL (nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma, NLPHL)和经典型HL (classical Hodgkin lymphoma, CHL),这两个HL具有一些共同的特征,在病变组织中仅有少数肿瘤性大细胞——霍奇金(Hodgkin)细胞和Reed-Sternberg (H/RS)细胞,而瘤细胞周围有大量反应性非肿瘤性的细胞。非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma,NHL)是一种原发于淋巴组织的恶性肿瘤,在恶性淋巴瘤中非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma, NHL)所占的比例远高于HL,很多国家NHL的发病率有增高趋向。NHL有如下病理组织学特点：正常淋巴组织结构被全部或部分破坏；可呈现大量单一异型淋巴细胞；癌变部位的异型淋巴细胞可浸润被膜及邻近正常组织；出现较多病理分裂相。CHL是单克隆性淋巴细胞肿瘤,病变由H/RS细胞组成,背景中有数量不等的非肿瘤性背景炎性细胞。约98%以上的H/RS细胞起源于生发中心阶段分化的成熟B细胞。KUppers等采用显微切割技术从组织切片上挑取单个H/RS细胞,通过单细胞PCR技术分析以及基因重排证实绝大部分的H/RS细胞来自淋巴器官生发中心(germinal center,GC)的前凋亡B细胞,也称为“残疾的B淋巴细胞”,该细胞具有B细胞表型丢失和发育不全的早期浆细胞分化潜能等B细胞分化紊乱的特点。本课题组多年来致力于HL的基础研究,构建了脂质体CD99基因稳定过表达的CHL细胞株L428细胞亚系,命名为“L428-CD99”,采用免疫细胞化学、实时荧光定量RT-PCR, Western blot,免疫荧光共聚焦、原位杂交、miRNA反义寡核甘酸瞬时转染、生物信息学分析等方法,在对L428-CD99细胞亚系进行系列鉴定后,观测上调CD99后L428细胞B细胞分化相关表型、细胞形态和细胞生物学行为等改变,明确上调CD99的H/RS细胞复现B细胞表型、打开向浆细胞分化的开关基因PRDMI并诱导向末端B细胞方向再分化的调控机制,为进一步阐述H/RS细胞的发生发展机制提供参考依据,本课题组运用荧光差异双向凝胶电泳技术对人源性L428-CD99细胞和空载体转染的L428-Con细胞进行进行双向凝胶电泳实验,结合软件分析和手工筛选,挖取了差异蛋白质点,采用灵敏且高通量的肽质量指纹图谱蛋白质鉴定方法鉴定差异蛋白,共获得38个与CD99作用相关的高质量蛋白质斑点,并从差异蛋白中挑选出Hematopoietic lineage cell-specific protein (HCLS1,HS1)蛋白作为研究对象。Hematopoietic lineage cell-specific protein是造血系细胞特异蛋白,简称HCLS1或HS1,基因名称HCLS1,是一种表面抗原受体信号通路中酪氨酸激酶的底物。HCLS1主要在淋巴结,骨髓,脾,胸腺,扁桃体,外周血,粒细胞,巨噬细胞等表达,而在非造血组织中不表达。HCLS1是一种重要的B淋巴细胞受体(BCR)介导的信号转导分子,结合骨架蛋白,参与调节B淋巴细胞发育过程。同时,HCLS1蛋白的氨基端包含了类似的Jun-, Fos-, Myc-等双螺旋结构的蛋白家族的DNA链接序列,可能参与了信号传导以及转录因子的调节。研究表明,HCLS1是造血细胞中主要的酪氨酸激酶的作用底物,参与了胞外刺激因子介导的免疫应答以及细胞因子介导的分化,如在G-CSF的刺激下HCLS1与LEF-1相互作用,促进了LEF-1转入核内并介导了粒细胞的分化。同时,研究发现,HCLS1的敲低可导致促红细胞生成素介导的红细胞的分化,增殖能力减弱。然而,目前还未有HCLS1对于淋巴瘤相关分化机制的研究。HCLS1在L428-CD99中高表达,那么该蛋白是不是参与CD99调控H/RS细胞和B淋巴细胞转化中的重要调节蛋白呢?在HL以及其他B细胞淋巴瘤中的表达和功能又是如何呢?为此,本课题采用免疫组织和细胞化学、实时荧光定量RT-PCR、Western blot等方法,探究HCLS1在病理组织和淋巴瘤细胞中的表达与定位,干扰HCLS1基因后检测相关转录因子的表达以及细胞生物学行为的改变,初步确立HCLS1在HL及B细胞淋巴瘤中的功能和地位。目的1.HL组织以及细胞株L428及L428-CD99细胞亚系HCLS1的表达。2. HCLS1在B细胞淋巴瘤与细胞株的表达。3.调控HCLS1对B淋巴瘤细胞株再分化及增殖与凋亡的影响。探究干扰HCLS1基因对L428-CD99、OCI-Ly8、OCI-Ly10细胞增殖能力、凋亡和周期的影响。方法一、HL组织以及细胞株L428及L428-CD99细胞亚系HCLS1的表达利用western blot、Real-time PCR、细胞免疫化学检测L428及L428-CD99细胞中HCLS1的表达；采用实时荧光定量RT-PCR、western blot检测L428及L428-CD99细胞中HCLS1和CD99的表达。利用免疫组织化学检测HL组织中HCLS1的表达。二、HCLS1在B细胞淋巴瘤与细胞株的表达收集B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(B lymphoblastic leukaemia/lymphoma, B-ALL)、套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma,MCL)、滤泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma, FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(Marginal zone B-cell lymphoma, MZL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma, BL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(Small lymphocytic lymphoma,SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(Lymphoplasmacytic lymphoma, PL)临床病理标本,通过免疫组化方法观测HCLS1表达；进一步利用Western blot、Real-time PCR及免疫组化检测不同分化B淋巴瘤细胞株HCLS1的表达。三、调控HCLS1对B淋巴瘤细胞株再分化及增殖与凋亡的影响1.L428-CD99细胞、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞(OCI-Ly8、OCI-Ly10)瞬时干扰HCLS1基因对B细胞分化的影响L428-CD99细胞和OCI-Ly8、OCI-Ly10细胞瞬时转染HCLS1小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot检测HCLS1的干扰效率及B细胞分化相关基因PRDM1,Pax-5, Bcl-6以及Bcl-2的表达差异。2. L428-CD99细胞,弥漫大B细胞淋巴瘤细胞(OCI-Ly8、OCI-Ly10)瞬时干扰HCLS1基因对增殖与凋亡的影响利用CCK8实验、流式细胞仪检测,探究干扰HCLS1基因对L428-CD99、 OCI-Ly8、OCI-Ly10细胞增殖能力与凋亡的影响。四、统计学处理采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。CCK8法检测细胞增殖能力采用析因设计资料的方差分析和单因素方差分析(One-Way ANOVA),多重比较选用LSD法比较各组间差异。Real-time PCR检测HCLS1的表达水平采用多个独立样本非参数检验和两个独立样本非参数检验。流式细胞仪检测凋亡指数和细胞周期采用两样本t检验。real-time PCR检测PRDM1、Pax5、Bcl-6、和Bcl-2的表达水平采用两个独立样本非参数检验。按a=0.05水平,P≤0.05,差异具有统计学意义。结果(一)HL组织以及细胞株L428及L428-CD99细胞亚系HCLS1的表达1.实时荧光定量RT-PCR、western blot、免疫细胞化学检测结果显示,与L428细胞相比,过表达CD99的L428-CD99细胞HCLS1表达明显增强(T=14.54,P=0.005)。免疫组织化学检测结果HL组织中H/RS细胞呈弱阳性或者阴性表达(+/-),而周围背景B淋巴细胞均成强阳性表达(+++)；(二)HCLS1在B细胞淋巴瘤与细胞株中的表达1.实时荧光定量RT-PCR、western blot、免疫细胞化学检测结果显示HCLS1表达水平在BL细胞株：RaJi、Ramous、Daudi, DLBCL细胞株：OCI-Ly8、CI-Ly10,以及L428-CD99细胞系表达较高,在多发性骨髓瘤细胞株KM3、PRMI-8226细胞以及具有B母细胞肿瘤表型的多发性骨髓瘤IM9细胞株中HCLS1的表达水平较低。2.不同分化阶段的B细胞淋巴瘤组织免疫组化结果显示,HCLS1蛋白定位于细胞浆,在检测的B细胞源性的NHL组织B-ALL,FL,MCL,MZL,DLBCL, BL,SLL, PL中,HCLS1在瘤细胞胞浆弥漫阳性表达,阳性强度在(++-+++),其中在DLBCL(GCB型)中,瘤细胞均为强阳性(+++),低级别的FL中,肿瘤性滤泡的瘤细胞也是强阳性表达(+++),滤泡旁的细胞表达强度减弱(+-++),更有趣的是在肿瘤旁相对正常的淋巴组织中生发中心强阳性表达,而套区及滤泡间区弱阳性表达；经过统计学分析,NHL组织各组间HCLS1的表达无显著差异(X2=2.176,P=0.63)。(三)调控HCLS1对B淋巴瘤细胞株再分化及增殖与凋亡的影响1.成功构建了瞬时干扰HCLS1的L428-CD99细胞,OCI-Ly8细胞,OCI-Ly10细胞,结果显示瞬时干扰HCLS1基因之后,B细胞激活蛋白Pax-5以及生发中心标记物Bcl-6表达明显降低,浆细胞分化开关蛋白PRDM1降低,Bcl-2蛋白降低。2.瞬时干扰HCLS1基因之后,L428-CD99细胞,OCI-Ly8细胞,OCI-Ly10细胞的增殖能力减弱,细胞的增殖率降低,而对细胞的凋亡率影响不大。结论1.过表达CD99的L428细胞亚系L428-CD99细胞HCLS1的表达量增高,CHL组织中H/RS细胞呈弱阳性或者阴性表达(+/-),而周围背景B淋巴细胞均成强阳性表达(+++)；2.HCLS1在Raji、Ramous、Daudi、OCI-Ly8、OCI-Ly10、L428-CD99细胞系表达较高,而在IM9、KM3、PRMI-8226细胞系HCLS1的表达水平较低；HCLS1在生发中心以及生发中心后来源的肿瘤细胞高表达,B母细胞肿瘤以及浆细胞瘤中表达较低。3.HCLS1在不同分化阶段的B细胞淋巴瘤组织中普遍高表达。4.瞬时干扰HCLS1基因之后,生发中心的重要标记物Bcl-6、浆细胞分化开关蛋白PRDM1、B细胞特异性激活蛋白Pax5及凋亡和分化相关蛋白Bcl-2均降低。HCLS1很有可能参与调节B细胞相关分化基因的表达,在B细胞在生发中心以及生发中心后阶段的发育与分化起到关键的作用。5.瞬时干扰HCLS1基因之后肿瘤细胞的增殖能力减弱,肿瘤细胞的凋亡率没有明显变化。创新之处1.初步揭示HCLS1蛋白在不同分化B细胞淋巴瘤中的表达规律。2.首次提示HCLS1可能参与调节了B细胞相关分化基因的表达。