盐胁迫下甜菜不同倍性品种Na+/K+稳态平衡作用研究

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由于人为和自然等原因,土壤盐碱化愈来愈严重。植物在长期进化过程中已经形成了各种抵御盐胁迫的机制。糖类、脯氨酸、抗氧化酶和一些耐盐性基因等在植物的耐盐性中发挥着重要作用。已有研究表明,植物倍性不同其耐盐性也有所不同,为保证植物正常生长及提高作物产量,在作物育种中选择更加适应环境的植物是必要的。本论文研究以甜菜(Beta vulgaris L.)品种―TY03410‖(四倍体)和―TY03209‖(二倍体)为材料,探究盐胁迫对其生理特性及Na+、K+吸收与转运相关功能基因(Bv NHX1、Bv SOS1、Bv HKT1;1、Bv AKT1、Bv HAK5和Bv SKOR)表达模式的影响,并采用CRISPR/Cas9技术构建Bv NHX1基因编辑载体,取得了如下主要结果:(1)在300 mmol/L Na Cl(高盐)胁迫下,四倍体较二倍体细胞内积累了更少的Na+、更多的K+和较高的K+/Na+,以及较高的可溶性糖、果糖和蔗糖含量。由此可见,在高盐处理下,与二倍体相比,四倍体品种通过维持体内离子稳态平衡,以及积累有机物质来降低细胞渗透势从而响应盐胁迫。(2)在高盐胁迫下,四倍体的丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和过氧化物酶(POD)活性较四倍体显著降低,可见在高盐条件下,甜菜四倍体受到胁迫伤害的程度可能会更低。(3)在四倍体中,与对照相比,在低盐(50 mmol/L)胁迫下,叶中Bv AKT1和Bv HAK5在24 h时分别瞬时上调了3.9和6倍,在根中均下调。在高盐胁迫(200和300 mmol/L)下,Bv AKT1在叶中分别上调了1.5~2.6和3.1倍,根中轻微上调。在二倍体中,在不同浓度盐处理下,叶中Bv AKT1较对照均无明显变化,根中Bv AKT1较对照均下调。四倍体与二倍体相比,二者根和叶中Bv HAK5表达水平差异不显著。由此可见,在高盐胁迫下,Bv AKT1在四倍体介导根K+的吸收,而在二倍体介导K+吸收的能力受到抑制。(4)对于Bv SKOR,与对照相比,低盐胁迫均使在四倍体和二倍根中的Bv SKOR表达水平略有增加,但差异不显著;高盐胁迫下,该基因转录丰度在四倍体和二倍体根中显著增加,但在四倍体中的表达水平显著高于二倍体。由此表明,Bv SKOR在四倍体中介导K+从根向地上部运输的能力更强。(5)对于Bv HKT1;1,低盐条件下,四倍体和二倍体叶和根中的表达水平较对照均显著增加,但在两个品种中差异不显著;然而,在高盐条件下,四倍体叶和根中的表达丰度显著上调,并且显著高于二倍体。这就表明,在高盐浓度下,四倍体中根系Bv HKT1;1通过韧皮部回收多余Na+,从而使地上部叶片免受过多Na+的毒害。(6)Bv SOS1表达水平在不同盐浓度下差异不大,且甜菜四倍体Bv SOS1的表达水平均高于二倍体且主要在叶中大量表达。在低盐条件下,与对照相比,24h时Bv NHX1在四倍体叶中瞬时上调了2.1倍,12 h时在二倍体叶中上调了0.3倍;Bv NHX1在四倍体根中增加了30%,在二倍体根中均下降。在高盐条件下,四倍体叶和根中Bv NHX1较对照显著上调且表达水平显著高于二倍体。由此推测,四倍体根和叶中排出和区域化Na+的能力更强。(7)选取Bv NHX1基因第五个外显子中第3244-3263bp间的20个碱基作为靶位点,以中间载体p YLsg RNA-At U6-29和表达载体p YLCRISPR/Cas9-B为基础,通过重叠PCR和金门克隆的方法构建了Bv NHX1-sg RNA表达盒,得到了Bsa I-HF酶切的p YLCRISPR/Cas9载体和Bv NHX1-sg RN A表达盒的连接产物。
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