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大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一种,具有众多毒力因子,如:stxl、2编码的Vero细胞毒素Ⅰ、Ⅱ,eaeA基因编码的紧密素,hty编码的溶血素,uidA编码的β-葡萄糖苷酸酶,可引起人的出血性结肠炎(HC),引发溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等并发症。
为了解广东分离株大肠杆菌O157:H7携带毒力基因的情况,本研究针对O157:H7stx基因、hly基因、eaeA基因和uidA基因,根据参考文献和发表序列分别设计5对检测引物和8对克隆引物。5对检测引物分别特异性检测上述5种基因;8对克隆引物分别扩增stxl、2基因,hlyA、B、C、D基因,eaeA基因和uidA基因的全长开放阅读框。
使用特异性引物检测,结果显示:4株(021210、03048、03511、03512)大肠杆菌O157:H7中,021210株具有stx2基因、hly基因、eaeA基因和uidA基因;其他3株(03048、03511、03512)不携带上述任何一种毒力因子。
使用克隆引物PCR扩增,结果显示:从021210株中可以扩增出与上述符合基因(stx 2基因,hlyA、B、C、D基因和uidA基因)理论大小的特异性条带。其他3株(03048、03511、03512)未出现任何符合上述基因理论大小的特异性条带。
将021210株0157:H7的stx2基因,hlyA、B、C、D基因和uidA基因进行T-A克隆,测序结果表明:
021210株的stx2A基因长度为960bp,编码319个氨基酸残基;stx2A基因核苷酸与GenBank发表的序列同源性在99.1%-100%之间;推导氨基酸与GenBank发表的序列同源性在90%-97.8%之间。stx2B基因长度为270bp,编码89个氨基酸残基;stx2B基因核苷酸GenBank发表的大部分序列同源性为100%,推导氨基酸与GenBank发表的序列同源性在94.4%-100%之间;表明stx2B基因在大肠杆菌O157:H7中高度保守。
021210株的hlyA基因长度为2997bp,编码998个氨基酸残基;hlyA基因核苷酸与GenBank发表的序列同源性在98.3%-100%之间;推导氨基酸与GenBank发表的序列同源性在85.8%-99.3%。
021210株的hlyB基因长度为2121bp,编码706个氨基酸残基;hlyB基因核苷酸与GenBank发表的序列同源性在99.1%-100%之间;推导氨基酸与GenBank发表的序列同源性在81.6%-99.1%。 021210株的hlyC基因长度为492bp,编码163个氨基酸残基;hlyC基因核苷酸与GenBank发表的序列同源性在98.2%-100%之间;推导氨基酸与GenBank发表的序列同源性在86.5%-100%。
021210株的hlyD基因长度为1440bp,编码479个氨基酸残基;hlyD基因核苷酸与GenBank发表的序列同源性在98.8%-100%之间;推导氨基酸与GenBank发表的序列同源性在88.9%-98.7%。
021210株的uidA基因的长度为1814bp;uidA基因核苷酸与GenBank发表的序列同源性在98.9%-99.9%之间;与其他表现GUD活性的大肠杆菌0157:H7相比较,发现:021210株的uidA基因于+686位点存在插入G-G序列,使得021210株uidA基因长度为1814bp,同时该插入使整个编码氨基酸错框,蛋白无法翻译表达,细菌不表现β-葡萄糖苷酸酶活性。
将021210株的six2基因,hlyA,B、C、D基因和uidA基因序列分别向GenBank递交,登陆号分别为:EF079674、EF088504、EF079671、EF079672、EF079673和EF520726。
Vero细胞毒性试验显示:021210株具有较高的Vero细胞毒滴度,而其他3株则不表现Vero细胞毒性。