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CpG寡核苷酸(CpG oligodexynucleotides, CpG ODN)是一类在细菌中普遍存在的以非甲基化CpG为核心的DNA序列。已有研究表明,其通过Toll样受体9(Toll-like receptor 9, TLR9)直接活化B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞,上调免疫刺激分子的表达,调节免疫反应,诱导IL-6、IL-10以及IL-12等细胞因子分泌;此外还能间接激活NK细胞,T淋巴细胞。因此CpG ODN作为一种高效低毒的免疫激活剂,成为免疫学研究的热点。本研究在课题组筛选出的对猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)具有最佳刺激活性的CpG基序(CpG motif)的基础上,人工合成了含有5拷贝CpG基序的寡聚脱氧核苷酸,并在两端设计2对酶切位点,通过定向克隆和平末端克隆将其分步串联到pcDNA3.0载体中,构建出一组含有不同拷贝数(5、10、20、40、80拷贝)CpG基序的重组质粒,分别命名为pcDNAACpG-1、pcDNAACpG-2、pcDNAACpG-3、pcDNAACpG-4和pcDNAACpG-5。用已构建的pcDNAACpG-3、pcDNAACpG- 4和pcDNAACpG- 5按每孔1.25μɡ、2.5μɡ、5.0μɡ、10.0μɡ的剂量刺激猪PBMC,通过MTT比色法测定淋巴细胞的增殖能力和代谢强度进行体外淋巴细胞转化试验。通过比较各重组质粒及同一质粒在不同剂量下对猪PBMC的刺激效果,筛选出对猪具有最佳免疫活性的重组质粒及其剂量。结果显示,三种质粒对猪PBMC均产生了不同程度的刺激,与阴性对照组相比差异均显著(P<0.05),其中5.0μɡ的pcDNAACpG-3刺激指数达7.377,表明pcDNAACpG-3具有最佳的免疫刺激活性,最佳剂量为5.0μɡ。利用高密度发酵大肠杆菌与大规模纯化DNA工艺获得大量pcDNAACpG-3重组质粒。分别用500μɡ和250μɡ的pcDNAACpG-3重组质粒与O型口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)灭活疫苗联合免疫仔猪,以分析pcDNAACpG-3重组质粒对O型FMD灭活疫苗免疫效果的影响。将32头30日龄健康仔猪随机分为4组,分别为生理盐水组,疫苗对照组,250μɡ联合免疫组,500μɡ联合免疫组。在免疫后0天、14天、28天、42天、56天、70天、84天前腔静脉采血并分离血清,采用液相阻断ELISA法检测血清中的FMDV特异性抗体效价。结果显示,500μɡ和250μɡ联合免疫组仔猪在初次免疫后的第14天到28天均检测出了高效价的FMDV特异性抗体,效价分别达101.17～101. 49和101. 04～101. 39,与同期疫苗对照组(10 0. 70～10 0. 84)相比差异极显著(P<0.01);且在整个免疫期间,所有联合免疫组的抗体效价均高于疫苗对照组,表明含CpG基序的重组质粒能作为一种有效的疫苗免疫佐剂提高O型FMD灭活疫苗的体液免疫应答水平。