论文部分内容阅读
商陆皂甙甲(Esculentoside A,EsA)是中药商陆中含量最高的皂苷。近二十多年的研究表明EsA具有广泛的药理作用。前期研究发现商陆皂甙甲有显著的抗炎免疫作用,EsA能抑制淋巴细胞和巨噬细胞释放多种细胞因子和介质,如白介素-1(Interleukin -1,IL-1)、白介素-2(Interleukin -2,IL-2)、白介素-6(Interleukin -6,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)、血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)、免疫反应性纤维结合素(Immunoreactive fibronectin-γ,IFN-γ)和一氧化氮(Nitric Oxide,NO)等,而这些因子在炎症和免疫反应中都起到重要的作用。同时,EsA能够抑制巨噬细胞的吞噬作用,并对小鼠的自身免疫性疾病有作用。基因芯片结果显示EsA可能通过对NO、金属蛋白酶、转化生长因子-β(Transforming growth factor,TGF-β)、免疫亲和素等相关的基因靶群的调节而起抗炎及免疫调节作用。糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是一种使糖原合成酶磷酸化的多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,能调节许多细胞功能,包括细胞的生长,代谢,基因转录,蛋白翻译,细胞骨架组构、细胞周期进程以及细胞的脱噬作用等。最近研究发现GSK3β还能调控炎症过程,可能与老年性痴呆、糖尿病和肿瘤等疾病有关。此外,GSK3β还参与白介素-10(Interleukin -10,IL-10)和TNF等多种细胞因子和炎症介质表达的调节。Nitric oxide (NO)在心血管,免疫以及神经系统中是一个重要的信使分子, PIN可与NO合酶NOS特异性的结合,此外研究发现PIN与细胞骨架蛋白LC8为同一物质,能与转录调节子IκB,促细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白Bim等相互作用,来调节许多细胞功能,包括细胞周期的调控,细胞的脱噬作用以及细胞极性的维持。本研究从ESA抗炎免疫调节作用相关基因靶群中挑选了glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β,AF156099)和protein inhibitor of nitric oxide synthase (PIN,AF020185)两条生物学功能尚不十分清楚的基因,克隆GSK3β和PIN全长cDNA,构建表达载体,然后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,研究GSK3β和PIN高表达对小鼠巨噬细胞功能的影响,包括巨噬细胞吞噬功能、细胞因子(IL-1、IL-6、TNF)和炎症介质NO释放,从而证明其在炎症和免疫中的作用。主要研究结果如下:(1)构建了pcDNA3.1-GSK3β和pcDNA3.1-PIN真核表达载体,脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选获得GSK3β和PIN高表达细胞系;采用Western Blot方法验证发现,RAW264.7细胞转染pcDNA3.1-GSK3β后GSK3β表达显著高于细胞转染pcDNA3.1质粒对照。(2)采用中性红染色法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的吞噬功能,结果显示高表达GSK3β和PIN能够抑制RAW264.7细胞吞噬功能;(3)采用Griess法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的上清中一氧化氮(NO)含量,结果显示高表达GSK3β和PIN能够显著抑制LPS刺激RAW264.7细胞产生NO;(4)采用结晶紫染色法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的上清中的肿瘤坏死因子(TNF)活性,结果显示高表达GSK3β和PIN能够显著促进LPS刺激RAW264.7细胞产生TNF;(5)采用Western Blot方法,分析GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞中相关抗炎免疫因子IL-1,IL-6的蛋白表达的变化,结果显示GSK3β和PIN高表达显著促进LPS刺激RAW264.7细胞产生IL-6,但对IL-1表达无影响。以上结果表明,高表达GSK3β和PIN能选择性抑制LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能和炎症介质NO的产生,促进致炎的细胞因子TNF和IL-6的产生,但对IL-1产生无影响,表明GSK3β和PIN具有调节巨噬细胞参与炎症反应的功能,提示ESA可能通过上调GSK3β和PIN基因表达来发挥抗炎免疫调节作用。