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1目的与意义当生物体受到外界病原体侵袭时,生物机体自身会启动主动防御来抵抗侵袭。中性粒细胞是机体主动防御系统中重要组成部分,具有多种抗微生物活性蛋白和肽类,其中就包括杀菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/Permeability-increasing Protein, BPI)和防御素(Defensins)。在对奶牛乳房炎疾病的研究发现,一些p-防御基因在奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达,说明在患乳房炎时p-防御素可能在乳腺局部防御中发挥作用。同时,防御素具有抑制革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria, G")和革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria, G+)的活性,其对奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)及大肠杆菌(Escherichia Coli)均有抑制作用。因此其有可能是作为奶牛抗乳房炎的候选基因,在预防和防治乳房炎方面具有重要的意义。此外,在奶牛的养殖过程中,内毒素引起的病发症至今仍没有很有效的治疗手段,而BPI有可能在治疗内毒素病发症上发挥作用。同时,BPI具有特异的抗G-能力,恰好弥补了防御素在抗G-能力上的不足,且BPI和防御素对细菌均不易产生耐药性。鉴于此本试验拟采用基因工程技术,通过构建BPI和防御素融合蛋白,以达整合它们生物活性的目的,使之抗菌谱更广、抗菌能力更强,并以期其能用于更多疾病的治疗。除此之外,融合蛋白的构建也正好可以解决小分子多肽或蛋白因半衰期较短而容易降解的问题,还可增加基因产物。因此,构建BPI和防御素融合表达载体并表达其融合蛋白是十分有意义和价值的。2方法与结果(1)本试验以具有临床乳房炎症状的荷斯坦奶牛为试验材料,提取血液白细胞总RNA。根据GenBank中牛BPI基因序列(序列号：BC102310.1,GI：74354930),设计引物,并在引物的5’端引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。采用RT-PCR技术,巢式PCR的方法扩增出BPI基因N-端的cDNA序列,片段大小为714bp。构建pEASY-T1-BPI质粒,克隆测序。BLAST比对结果显示：核酸序列同源性达99%,氨基酸序列同源性达100%。根据GenBank中牛BNBD4基因序列(序列号：NM 174775.1,GI：28849940),设计引物,并在引物的5’端引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点。采用RT-PCR技术扩增出BNBD4基因的cDNA序列,片段大小为192bp。构建pBluescript-BNBD4质粒,克隆测序。BLAST比对结果显示：核酸序列同源性达100%。(2)首先线性化(EcoR I和SalⅠ)空载的pET-28a(+)质粒,将BPI基因与其连接,构建pET-BYI质粒。然后再线性化(HindⅢ和XhoⅠ) pET-BVl质粒,将BNBD4基因与其连接,构建出pET-BPI-BNBD4融合表达质粒。(3)对含有重组pET-BPI-BNBD4质粒的工程菌进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE显示37℃下IPTG浓度为1.0mmol/L时,诱导4h时蛋白表达量最高,且上清和包涵体中均有大小约为37.3kDa的融合蛋白出现,其大小与生物信息软件ProtParam分析一致。Western blot鉴定结果显示在相应的位置同样出现清晰的蛋白条带。(4)融合蛋白体外抑菌试验：琼脂孔扩散法和酶标仪检测均表明,融合蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出抑制作用。3结论本试验成功克隆了牛BPI基因N-端和BNBD4基因的编码序列,构建了pET-BPI-BNBD4融合表达载体,并成功表达了目的蛋白BPI-BNBD4。体外抑菌试验证明融合蛋白具有抗革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的生物活性。本研究为下一步融合蛋白完整的生物活性的检测奠定了基础。