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目的探讨透骨消痛胶囊含药血清影响软骨细胞周期与凋亡的作用机制。方法1.新西兰大白兔60只,抽签法随机分为空白组(0.9%生理盐水灌胃)、对照组(壮骨关节丸5 mg／ml溶液灌胃)、实验1组(透骨消痛胶囊2.5 mg／ml溶液灌胃)、实验2组(透骨消痛胶囊5 mg／ml溶液灌胃)、实验3组(透骨消痛胶囊10mg／ml溶液灌胃),20m1／次,2次／天,连续3天,腹主动脉采血,制备含药血清。2.新西兰大白兔32只,取膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,甲苯胺蓝染色、RT-PCR检钡CollageⅡmRNA鉴定。第3代软骨细胞同步化,抽签法随机分为空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组,分别加入含15%各组血清DMEM培养24 h、48 h、72h,MTT检测软骨细胞的活性,流式细胞仪检测软骨细胞周期的分布,确定含药血清的有效干预时间。第3代软骨细胞同步化,抽签法随机分组分别加入含15%各组血清DMEM培养72 h,荧光倒置相差显微镜、光学显微镜、透射电子显微镜观察软骨细胞的形态结构,RT-PCR检测软骨细胞CyclinD1、CDK4、p21 mRNA表达。3.第3代软骨细胞培养72 h,抽签法随机分为凋亡1组(SNP终浓度0 mmol／L)、凋亡2组(SNP终浓度0.5 mmol／L)、凋亡3组(SNP终浓度1 mmol／L)、凋亡4组(SNP终浓度2 mmol/L)干预24 h,荧光倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构,Hocehst 33342染色鉴定软骨细胞的凋亡,MTT检测软骨细胞的活性,确定SNP诱导软骨细胞凋亡的量效关系。4.第3代软骨细胞培养72 h,抽签法随机分为空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组,分别加入含SNP终浓度为1 mmol／L 15%各组血清DMEM培养12 h、24 h、36h,MTT检测软骨细胞的活性,确定含药血清的有效干预时间。第3代软骨细胞培养72 h,抽签法随机分组分别加入含SNP终浓度为1 mmol/L 15%各组血清DMEM培养24 h,MTT检测软骨细胞的活性,Hocehst 33342染色检测软骨细胞的凋亡率,荧光倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察软骨细胞的形态结构,Annexin V-FITC/PI检测软骨细胞的早期凋亡,RT-PCR检测软骨细胞p53、Bcl-2 mRNA表达,比色法检测软骨细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性。结果1.原代、第2代、第3代软骨细胞甲苯胺蓝染色,胞浆内呈紫红色异染颗粒；原代、第2代、第3代、第4代、第5代软骨细胞CollageⅡmRNA表达逐渐降低,原代、第2代、第3代明显高于第4代、第5代(P<0.01)。透骨消痛胶囊含药血清促进软骨细胞增殖的有效作用浓度为15%,有效作用时间为72 h；干预72 h,软骨细胞的表型稳定；软骨细胞OD值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞CyclinD1、CDK4 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞p21mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)。2.干预24 h,SNP诱导软骨细胞凋亡的有效作用浓度为1 mmol/L。透骨消痛胶囊含药血清抑制软骨细胞凋亡的有效作用时间为24 h；干预24 h,软骨细胞OD值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞的凋亡率,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)；软骨细胞p53 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)；软骨细胞Bcl-2 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)。结论1.透骨消痛胶囊含药血清能上调软骨细胞周期正向调节因子CyclinD1、CDK4表达,下调负向调节因子p21表达,加速软骨细胞周期关键限制点G1/S期的切换,促进软骨细胞周期的进程,并能维持软骨细胞的表型稳定。2.透骨消痛胶囊含药血清能下调软骨细胞促凋亡基因p53、Caspase-9、Caspase-3表达,上调抗凋亡基因Bcl-2表达,抑制软骨细胞线粒体凋亡通路的信号转导。