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研究背景和目的:嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞治疗已经在某些血液瘤中取得了突破,在一些实体瘤治疗如肝细胞癌、胃癌、胰腺癌中也有了不错的进展。但是其治疗安全性和在实体瘤中的有效性仍然需要进一步提高。比如说,在CAR T细胞治疗急性淋巴细胞白血病中,疾病缓解率很高,但存在较高频率的细胞因子释放综合征和神经毒性,因此如何增强其安全性变得十分迫切。而我们在国际上开发的首个针对GPC3靶点的CAR T细胞用于治疗肝细胞癌的临床研究中,尽管呈现了很好的安全性,但是其疾病缓解率尚不高,因此如何进一步提高其有效性也是重要的问题。在这项研究中,我们尝试在CAR T细胞治疗中应用抗体偶联药物CH12-MMAF以及一种新的安全开关,以提高CAR-T细胞治疗的安全性。同时,我们也通过联合使用靶向药物索拉非尼(一种FDA批准的酪氨酸激酶抑制剂)来增加GPC3靶向CAR T细胞的抗肿瘤活性。研究方法:为了解决CAR T细胞治疗时产生不良反应的安全性问题,我们使用抗体偶联药物CH12-MMAF来特异性清除体内的CAR T细胞。我们在CAR T细胞中表达融合受体,FR806。该受体可被CH12-MMAF选择性靶向并介导其内化。通过流式细胞术检测了FR806和CAR在T细胞中的表达。并且,我们在体外实验和NOD/SCID小鼠中分别检测了CH12-MMAF对表达FR806的CAR T细胞的清除效能。为了提高GPC3-CAR T细胞在肝癌中的抗肿瘤活性,我们将GPC3-CAR T细胞与多激酶抑制剂索拉非尼进行联合应用。首先,我们使用小鼠脾脏T细胞构建了GPC3靶向的小鼠CAR T细胞,并且在免疫完善小鼠中建立了小鼠GPC3-CAR T细胞治疗Hepa1-6-ch GPC3小鼠肝癌移植瘤模型。随后,我们在体外观察了索拉非尼对小鼠GPC3-CAR T细胞体外活性的影响,并测试了小鼠GPC3-CAR T细胞和索拉非尼对小鼠肝癌移植物模型的联合治疗效果。在机制探索中,我们研究了索拉非尼与小鼠GPC3-CAR T细胞及小鼠巨噬细胞之间的相互作用。最后,我们在体外评估了索拉非尼对人外周血单个核细胞来源的GPC3-CAR T细胞功能的影响,并体内测试了索拉非尼与人GPC3-CAR T细胞在免疫缺陷小鼠人肝癌移植物中的联合作用。通过免疫组织化学染色分析探索了两者在免疫缺陷小鼠中的协同机制。结果:在提高CAR T细胞安全性的研究结果中,我们发现表达FR806的CAR T细胞能够被CH12-MMAF靶向。CH12-MMAF是一种抗体偶联药物,能够识别EGFR中的806隐蔽表位,但不识别健康组织野生型EGFR。CH12-MMAF能够被表达FR806的T细胞内吞,并且能有效杀伤这些细胞。在免疫缺陷的小鼠中,CH12-MMAF有效清除了小鼠体内表达FR806的CAR T细胞。在关于GPC3-CAR T细胞的研究结果中,首先,我们发现小鼠GPC3-CAR T细胞在免疫完善小鼠模型中能够诱导小体积肿瘤(约130mm~3)的消退,但是对大体积的肿瘤(约400mm~3)没有明显治疗效果。通过进一步体内外实验表明,药理剂量(体外10μM;体内30mg/kg)下的索拉非尼能够明显抑制小鼠GPC3-CAR T细胞的功能,而低于药理剂量(体外1-5μM;体内7.5mg/kg)的索拉非尼能够增强小鼠GPC3-CAR T细胞的抗肿瘤作用,其中部分机制是通过促进肿瘤相关巨噬细胞中IL-12的分泌。最后我们发现,药理剂量和低于药理剂量的索拉非尼在体外对人GPC3-CAR T细胞的功能没有明显影响。在免疫缺陷小鼠模型中,药理剂量和低于药理剂量的索拉非尼与人GPC3-CAR T细胞联合应用时,相比较单独用药组都具有更好的肿瘤生长抑制效果。免疫组织化学染色分析显示出两者具有共同促进肿瘤细胞凋亡的协同机制。结论:本研究表明,抗体偶联药物CH12-MMAF可被用于特异性清除体内表达FR806的CAR T细胞。CH12-MMAF对806表位的高特异性以及叶酸受体介导的内吞能力使得CH12-MMAF&FR806系统有望成为提高CAR T细胞治疗安全性的有效工具。此外,我们的结果表明小分子抑制剂索拉非尼可增强GPC3-CAR T细胞的抗肝细胞癌活性,为索拉非尼与GPC3-CAR T细胞的临床联合治疗肝细胞癌提供了重要的实验及理论依据。