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病毒病是果树主要病害之一。随着果树面积的不断扩大和栽培时间的延长,病毒的危害越来越明显,已引起广大科技人员重视,无病毒化生产是防治病毒的主要措施。果树无毒化生产要求一种准确、灵敏、简便、快速的病毒检测方法,传统的木本指示植物检测准确可靠,但耗时长;而血清法检测的抗血清制备难度大、价格昂贵。因此为满足果树苗木检疫和无毒化生产的需要,摸索一种准确、灵敏、快速、简便的检测方法十分必要。近年来分子检测技术为果树病毒的检测提供了新的有力工具。新疆库尔勒香梨因其独特的风味品质而受到广大消费者的喜爱,是新疆出口创汇的主要产品之一。但近年来,发现新疆库尔勒香梨普遍带有病毒,给新疆的香梨的发展带来巨大的隐患,因此,开展新疆香梨病毒分子检测研究具有十分重要的理论和实际意义。 本研究主要包括库尔勒香梨主要病毒RT—PCR检测技术、cDNA探针检测技术、试剂盒的组装及对样品的检测。 1.获得了适合于香梨树各组织（花、芽、叶、皮层）总RNA的提取方法,所提取的总RNA可很好地用于RT—PCR研究和核斑点杂交的周年检测。 2.根据ACLSV、ASPV两种病毒基因组序列分别设计相应引物,扩增出683bp、361bp保守特异性片段用于RT—PCR、NASH。序列比较其核苷酸相似性分别为83.75%、79.5%。 3.优化了香梨病毒的RT—PCR检测方法,结果表明:RT体系中各药剂的终浓度为RNasin 1.25U/μL互补引物0.500μmol/L、dNTPs 1.0mmol/L、AMV 1U/μL,PCR体系中各药剂的终浓度为MgCl21.5mmol/L,dNTPs0.20mmol/L,引物浓度1.0μmol/L,Taq E浓度0.1 U/μL时;可以获得很强的特异性带。 4.利用克隆后提取的质粒进行生物素标记cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究,结果表明:探针浓度为400ng/ml（ACLSV）,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6小时,可获得最高灵敏度,进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好。Tween20封闭效果比3%牛血清白蛋白的好。针对常规核酸杂交过程长,操作复杂的问题,较大的改进了杂交程序,使一个检测周期从22h缩减至5h,提高了病毒NASH的检测效率。 5.组装了基于RT—PCR检测体系的试剂盒和基于生物素标记cDNA探针的优化杂交检测试剂盒。通过检测样品表明:该试剂盒具有高效、快速、准确、稳定的优点。