目的:探讨吲哚胺2,3双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)在真菌性角膜炎中的表达、介导真菌性角膜炎真菌免疫耐受的功能以及相关的模式识别受体对其调控的机制。方法:本研究分别在真菌性角膜炎患者、体外培养的人角膜上皮细胞真菌感染的细胞模型以及真菌性角膜炎小鼠动物模型上研究了IDO的表达规律、IDO介导真菌性角膜炎中真菌免疫耐受的功能及相关的模式识别受体对IDO及下游炎症因子的调控机制。据此,实验分以下三个方面:1.选择2012年1月至2014年12月在青岛大学附属医院眼科就诊的真菌性角膜炎初诊患者31例(31眼)为真菌感染组,根据角膜溃疡的严重程度及裂隙灯下的炎症评分分为轻、中、重度感染三组,收集角膜病灶周围的角膜上皮组织;同时收集角膜移植中健康供体制作角膜植片后剩余的周边角膜缘组织6例(6眼)为正常对照组,刮取植片的角膜上皮组织。免疫荧光法检测临床真菌性角膜炎患者角膜组织中IDO的表达与定位,q RT-PCR法检测正常对照组和真菌性角膜感染组中IDO的表达差异及其与真菌性角膜炎感染严重程度之间的关系。建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染模型,免疫组织化学染色、q RT-PCR法、Western blot法进一步明确真菌性角膜炎角膜组织中IDO的表达规律。2.体外培养人永生化角膜上皮细胞,加入烟曲霉菌孢子刺激液,q RT-PCR检测不同作用浓度及时间点角膜上皮细胞中IDO的表达,筛选作用显著的刺激液;q RT-PCR及ELISA检测1-MT(IDO特异性的抑制剂)预处理后烟曲霉菌刺激液诱导的角膜上皮细胞IDO表达的改变以及对IDO下游炎症因子分泌的影响。将健康的C57BL/6小鼠随机分为对照组(给予PBS饮水预处理,刮取直径约2mm的中央角膜上皮,覆盖角膜接触镜)、烟曲霉菌感染组(刮取直径约2mm的中央角膜上皮后接种真菌,覆盖角膜接触镜)和1-MT预处理+烟曲霉菌感染组(IDO的抑制剂1-MT饮水预处理后,刮取中央角膜上皮后接种真菌,再覆盖角膜接触镜),根据感染的严重程度进行炎症评分,收集小鼠的角膜行q RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术,比较IDO阻断前后角膜的感染严重程度的评分,检测IDO的表达、定位及其对IDO下游的炎症因子表达的影响,观察IDO阻断前后角膜、淋巴结及脾脏组织中Th17和Treg细胞含量之间的变化,从而分析IDO介导真菌免疫耐受的相关机制。3.(1)体外培养人的角膜上皮细胞,给予不同的模式识别受体Dectin-1、TLR2、TLR4的特异性配体,q RT-PCR筛选角膜上皮细胞中调控IDO表达的模式识别受体;(2)分别给予1-MT,Dectin-1的激动和抑制剂预处理,在烟曲霉菌孢子诱导的人角膜上皮细胞的IDO诱导模型上,应用q RT-PCR、ELISA和Western blot检测Dectin-1对IDO及其下游炎症因子的调控。结果:1.(1)对临床真菌性角膜炎患者的病变角膜组织行免疫荧光染色在蛋白水平证实IDO在正常的角膜上皮组织中无或极少量的表达,而在烟曲霉菌性角膜炎患者角膜组织中IDO的表达明显增加并主要表达于角膜上皮组织中。(2)在临床真菌性角膜炎患者的角膜上皮组织中,q RT-PCR检测显示:与正常对照组相比,真菌性角膜炎患者的角膜上皮组织中的IDO m RNA表达明显增加,并且随着感染及炎症程度的增加,IDO的表达升高越明显,轻、中、重度各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染的模型中q RT-PCR结果显示真菌感染后IDO m RNA表达明显增高,1d达到高峰,之后开始降低。Western blot结果显示IDO的蛋白水平在真菌感染后1d开始增加,3d达高峰。2.(1)在体外培养的人角膜上皮细胞中,灭活的烟曲霉菌孢子可以诱导上皮细胞中IDO的表达量增加,并呈现出浓度依赖的变化趋势。q RT-PCR结果显示:与烟曲霉菌孢子刺激组相比,1-MT预处理组角膜上皮细胞中IDO及下游通路因子IL-1β、IL-6表达增加,ELISA检测在蛋白水平证实了相关的炎症因子的变化。(2)在C57BL/6小鼠和1-MT预处理鼠的烟曲霉菌感染模型中,疾病评分显示1-MT预处理鼠模型组的感染程度明显重于单纯的烟曲霉菌感染组,q RT-PCR、ELISA显示:与AF组相比,AF+1-MT组鼠角膜中IDO及IDO下游通路因子IL-1β、IL-6表达明显增加。q RT-PCR结果显示Th17型细胞因子(IL-17、IL-23)表达增加,Treg型细胞因子(IL-10、TGF-β)表达减少。流式细胞术的检查结果显示,与AF组相比,IDO阻断后小鼠真菌感染动物模型中角膜及脾脏组织中Th17细胞含量增加,Treg细胞含量减少,Th17/Treg细胞含量比增加,差异具有统计学意义。3.(1)采用不同的模式识别受体Dectin-1、TLR2、TLR4的特异性配体即Curdlan、Pam3csk4、LPS作用于角膜上皮细胞后,q RT-PCR检测显示TLR2、TLR4的特异性配体不能诱导IDO的表达,而真菌感染组和Dectin-1特异性的配体Curdlan组均能明显地诱导IDO的表达。给予Dectin-1的激动剂和抑制剂能够调控烟曲霉菌对IDO的刺激作用,Western blot检测在蛋白水平证实了这一变化。结论:1.IDO及其下游炎症因子在烟曲霉菌性角膜炎的发病机制中起重要作用。2.在烟曲霉菌感染的真菌性角膜炎中,烟曲霉菌可以通过Dectin-1/IDO这一信号通路,诱导角膜上皮细胞中IDO及其相关信号分子的表达,进而诱导Treg反应,抑制Th17反应,介导了烟曲霉菌的免疫耐受,促进了真菌性角膜炎炎症反应的慢性化。3.IDO的调控影响了烟曲霉菌导致的真菌性角膜炎相关的炎症反应,从而可能成为临床上新的治疗靶点。