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革兰氏阳性菌谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）,不仅仅是一株食品安全菌株Generally recognized as safe（GRAS）,也是工业生物技术的重要平台菌株。C.glutamicum最开始作为一株谷氨酸生产菌株而被分离,后面为了适应其他氨基酸的生产,逐渐通过代谢改造,用来实现精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸等氨基酸的生产,并获得了显著的成果。本研究中,通过筛选来源于C.glutamicum自身DNA复制过程中的DNA聚合酶Cgl1289,并搭配尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI、胞嘧啶脱氨酶（pm CDA1）以及腺嘌呤脱氨酶（Tad A-ABE8e）构建一系列突变质粒MPs,能够在C.glutamicum中实现高效的突变率以及广泛的突变谱。随后基于比较转录组学挖掘L-谷氨酸调控的转录调控因子,设计L-谷氨酸高通量检测方法,并结合MPs突变质粒定向选育L-谷氨酸高产突变菌株并进行比较全基因组测序分析,并基于比较全基因组测序分析以及代谢工程改造,打造L-谷氨酸高产菌株。最后通过转录调控因子RosR弱化发酵副产物以及增强L-谷氨酸分泌,进而提高L-谷氨酸发酵水平,主要研究结果如下:（1）C.glutamicum中内源性DNA聚合酶的筛选。Exo I包含两个高度保守的天冬氨酸和谷氨酸残基,是校对核酸外切酶活性的关键残基,影响着DNA复制修复系统的高保真性。根据Exo I区域的两个氨基酸残基的高度保守性,通过多序列比对,发现Cgl1289具有高度保守性的Exo I区域。随后,我们通过定点突变,将Cgl1289的两个天冬氨酸残基（D43）和谷氨酸残基（E45）突变为丙氨酸,并在C.glutamicum中进行表达。通过计算细胞存活率以及突变率,发现重组菌Cg-MP1的存活率仅有82.4%,突变率μbp达到了1.2×10-7,相对于对照菌株提高了3000倍。说明Cgl1289的Exo I区域中的天冬氨酸残基和谷氨酸残基突变为丙氨酸能够显著提高突变率。（2）突变质粒元器件组装与优化。当DNA复制过程中发生错误配对的碱基时,通过碱基切除修复系统（BER）和DNA聚合酶的作用下实现碱基的正确替换。因此,当DNA糖基化酶活性受到抑制时,就会扰乱碱基切除修复系统,从而提高碱基突变频率。于是,我们在已经得到了MP1的基础上,在Cgl1289M的下游串联表达了枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2来源的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）,并命名为MP2。结果表明,MP2的细胞存活率仅仅只有35.7%,μbp达到了3.6×10-7,相对于MP1提高了3倍。当DNA聚合酶的校对外切酶酶活性丧失了之后,胞嘧啶脱氨酶（pm CDA1）和腺嘌呤脱氨酶（Tad A-ABE8e）的表达便会显著提高DNA复制的错误。因此,我们在MP2的基础上,分别串联表达了胞嘧啶脱氨酶（pm CDA1）和腺嘌呤脱氨酶（Tad A-ABE8e）,分别构建了突变质粒MP3,MP4和MP5。结果表明,MP5的细胞存活率仅仅只有1.7%,突变率μbp达到了3.84×10-6,相对于MP1提高了32倍。随后我们通过启动子、RBS优化以及对诱导剂添加量和诱导温度进行优化,优化后的突变质粒MP5-RBS6的突变率最高(6.12×10-6),是野生型C.glutamicum的153000倍。最后利用温度敏感的复制起始位点Rep A 101替换原始的质粒复制起始位点,构建突变质粒MP5T,能够实现质粒的消除,终止突变,为构建稳定遗传的菌株构建基础。（3）谷氨酸高产底盘细胞的突变选育。首先利用突变质粒MP5T在C.glutamicum13032中突变选育得到了耐酸突变菌株NS-A1,且在5 L发酵罐发酵条件下能够积累L-谷氨酸35.3 g/L。随后,基于RosR与启动子PGlnA的相互作用,我们成功的构建了L-谷氨酸生物传感器PGlnA-biosensor。但是生物传感器PGlnA-biosensor不能专一性响应L-谷氨酸,为了在后续的突变筛选的过程中进一步专一性检测L-谷氨酸,我们利用谷氨酸氧化酶（LGOX）专一性氧化L-谷氨酸生成过氧化氢,构建了LGOX显色法。最后,结合MP5T突变质粒以及L-谷氨酸高通量筛选方法,并以耐酸突变株NS-A1为底盘细胞,进一步定向选育L-谷氨酸高产突变菌株,其中突变株NSH187在5 L发酵罐水平下能够积累L-谷氨酸55.8 g/L,产率0.372 g/g,且能够稳定遗传。最后通过对突变过程中获得的发酵L-谷氨酸前十的高产菌株以及三株耐酸突变株进行比较全基因组测序分析,发现部分单碱基突变涉及L-谷氨酸合成途径,进而影响着L-谷氨酸的生物合成。（4）系统代谢工程改造,打造L-谷氨酸高产菌株。首先通过在NSH187的基因组上增加双拷贝gdh,增强谷氨酸脱氢酶的活性,构建菌株CG1。利用启动子Ptuf增强ICD的表达以及启动子Pdap A增强GAPDH和GAPDHm的表达,进而构建了工程菌CG4,为GDH提供充足的NADPH供应。然后在CG4的基础上利用翻译起始速率弱的RBS序列弱化odh A的表达,并利用启动子Psod增强glt A的表达,分别构建了工程菌CG5和CG6。其中,CG6在5 L发酵罐中能够积累L-谷氨酸78.7 g/L,产率为0.436 g/g。通过在CG6的基础上整合PYC、PC和PEPC突变位点,以及利用启动子Psod增强ppc的表达,分别构建了工程菌CG7、CG8和CG9。其中CG9在5 L发酵罐中能够积累L-谷氨酸96.2g/L,产率为0.443 g/g。最后,在CG9的基础上,并利用启动子Psod增强ppgk和ilo T1的表达,构建了工程菌G01。菌株G01在5 L发酵罐中能够积累L-谷氨酸104.2 g/L,产率为0.452 g/g,且相对于CG9,降低了副产物乙酸、乳酸等积累。（5）转录调控因子RosR调控谷氨酸代谢合成网络。重组菌G01同样仍旧会存在L-谷氨酰胺、L-缬氨酸、L-丙氨酸、乙酸、乳酸等副产物积累,基于RosR的表达能够抑制L-谷氨酰胺的合成,且能够明显促进L-谷氨酸的积累。为了进一步削弱G01副产物的积累以及促进L-谷氨酸的生物合成,因此,我们在G01中过表达RosR。比较转录组学分析结合EMSA试验表明,RosR也能L-谷氨酸合成相关途径相关的众多启动子结合,通过分析RosR与DNA结合Motif相互作用发现,RosR中的Ser72和His76残基可以识别DNA结合Motif序列,进而调控着启动子区域下游基因的转录水平,参与L-谷氨酸代谢网络的调控,且显著削弱了副产物L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-丙氨酸、乙酸、乳酸和琥珀酸的积累。最后我们通过在G01的基因组上切除NCgl1221中的C末端110个氨基酸以及突变体Msc CG2I269V/F149L的整合,优化L-谷氨酸的胞外分泌,构建工程菌G05,同时在G05中过表达RosR。重组菌G05/RosR在5L发酵罐中发酵放大,发酵48 h能够积累L-谷氨酸152.1 g/L,产率0.565 g/g,相对于G01/RosR提高了16.5%和4.4%。