论文部分内容阅读
目的：本实验根据ARD1的基因序列,刷选出有效沉默的siRNA并转染三株人大肠癌细胞株LS-174、SW620和HCT-8。应用RT-PCR和Western blot方法从基因水平和蛋白水平检测siRNA对三株大肠癌细胞中ARD1的沉默效果。运用流式细胞技术检测转染后三株大肠癌细胞的凋亡变化来揭示hARD1的部分生物学功能及其在人大肠癌发生发展中的作用,为hARD1可能作为人大肠癌的肿瘤标记物及临床诊疗提供理论依据。方法：1. SW620、HCT-8和LS-174T细胞的培养；2. siRNA的设计与合成；3. siRNA转染SW620、HCT-8和LS-174T细胞,4.三株细胞总RNA的抽提和质检；5.转染后24h用RT-PCR检测各组中hARD1在三株大肠癌细胞中的沉默效率,转染后48h用VVestern b1ot检测各组中hARD1在三株大肠癌细胞中的沉默效率；6.在24h、48h和72h分别用Annexin V-FITC/Pl和Hoechst33342/PI对三株大肠癌细胞各组染色；7.用流式细胞仪检测其凋亡。结果：1. LS-174T、HCT-8和SW620细胞体外培养成功且生长状态良好；2.各组细胞总RNA样本质检结果均为28S/18S>0.7,为合格样本；3. siRNA能有效沉默ARD1的表达,转染后24h RT-PCR结果显示三株大肠癌细胞HCT-8、LS-174T和SW620中ARD1;冗默率分别为64.46%,53.03%,55.28%,各组siRNA转染前与转染后ARD1在基因水平表达差异具有统计学意义(P<0.05),提示转染后24小时转染的siRNA已经对三株细胞中ARDlmRNA表达有了较明显的抑制作用；转染后48h Western blot结果显示三株大肠癌细胞HCT-8、LS-174T和SW620的沉默率分别为86.22%,85.89%,85.73%, siRNA转染前与转染后ARD1在蛋白水平表达差异具有统计学意义(P<0.05),表明ARD1在蛋白水平的表达明显抑制。4.流式细胞仪检测结果显示：转染后24h、48h、72h可见三组细胞总凋亡率和早期凋亡率增加,阴性对照组和空白组差异具有统计学意义(P<0.05)；转染组与阴性对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：1.RNA干扰ARD1后可明显抑制三株人大肠腺癌细胞ARD1在RNA水平和蛋白水平的表达；2.沉默三株人大肠腺癌细胞ARD1的表达后,促进了细胞凋亡,推钡(?)ARD1可能是一个原癌基因。