星形胶质细胞是中枢神经系统(central nervous systems,CNS)中数量最多的细胞,参与维持CNS的生理功能。越来越多的证据表明,星形胶质细胞在众多神经退行性疾病,如帕金森病(Parkinson’s disease,PD)中发挥重要作用。当机体受到刺激时,小胶质细胞最先活化,分泌促炎因子,作用于星形胶质细胞,星形胶质细胞放大小胶质细胞介导的炎症反应,释放更多的促炎因子,从而形成恶性的反馈循环。活化的星形胶质细胞不仅加剧炎症信号的放大,还会生成谷氨酸及氧化应激产物,介导多巴胺(Dopamine,DA)能神经元死亡。PD是一种常见的神经退行性疾病,其病理特征表现为中脑黑质致密部(substantia nigra parscompacta,SNc)多巴胺能神经元进行性丢失和神经元胞内路易小体(Lewy body,LB)或路易神经突(Lewy neuritis,LN)聚积。星形胶质细胞作为血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的重要组成部分,其活化诱导基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)激活,破坏基底膜,增加BBB通透性,引起外周免疫细胞向脑实质浸润,进一步加剧PD发生发展中的炎症反应与DA神经元死亡。目前PD的致病机制尚未研究清楚,但众多证据表明,活化的星形胶质细胞及星形胶质细胞介导的神经炎症在PD病理过程中占有重要地位。神经炎症是众多神经退行性疾病的共同病理生理机制之一,主要由活化的胶质细胞引发,表现为炎性细胞因子的释放。在众多的炎症因子中,由Nod样受体蛋白(Nod-like receptor protein,NLRP)炎症小体活化而产生的白介素1β(inter1eukin-1β,IL-1β)在神经炎症中扮演着核心的角色。IL-1β参与多种神经退行性疾病的发生发展,包括PD、阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)、脑卒中、抑郁症等。目前NLRP3炎症小体是被研究最广泛的炎症小体,在PD的发病中可能承担了放大炎症反应、加重神经损伤的作用。因此,抑制NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β分泌可能是PD的一种治疗策略。多巴胺D2受体(Dopamine D2 receptor,Drd2)已被认为是神经退行性疾病有潜力的抗炎靶标。前期研究表明,星形胶质细胞Drd2通过调节抗炎蛋白a-crystallin表达,对维持中枢神经系统的免疫内环境稳态发挥重要作用。通常Drd2在活化后会激活下游两条信号通路——G蛋白依赖的信号通路和β-抑制蛋白(β-arrestins)依赖的信号通路。β-arrestins被募集至G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs),促进受体脱敏、内化,以及介导细胞增殖和凋亡等众多信号。目前尚无研究报道Drd2的G蛋白经典通路和β-arrestins非经典通路对星形胶质细胞炎症,尤其是对NLRP3炎症小体活化及活化后IL-1β的释放有何调节。在课题组前期研究基础上,本文第一部分工作运用NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠制备1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy1-4-peny1-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)PD慢性模型,通过小鼠行为学、脑内神经递质检测、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元等免疫组织化学检测等,研究NLRP3在PD小鼠模型发生中的作用。结果表明,敲除NLRP3可减轻MPTP诱导的小鼠PD样行为学障碍和神经损伤。实验进一步培养NLRP3-/-小鼠原代星形胶质细胞,运用星形胶质细胞条件培养基孵育SH-SY5Y细胞株,评价星形胶质细胞NLRP3敲除对MPP+诱导的神经元损伤的影响,结果表明星形胶质细胞NLRP3缺失可抑制MPP+引起的神经元损伤,发挥神经保护作用。在此基础上,第二部分工作应用PD小鼠模型并培养原代星形胶质细胞,在体、离体研究星形胶质细胞Drd2对NLRP3炎症小体活化的调节及其机制。结果表明,星形胶质细胞Drd2抑制NLRP3炎症小体介导的神经炎症,且该作用依赖于β-arrestin2;促进β-arrestin2与NLRP3结合可抑制炎症小体复合物的组装、活化,进而发挥神经保护作用。在第二部分研究基础上,我们进一步应用β-arrestin2偏爱型的Drd2激动剂UNC9995,深入研究星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2偏向型通路对PD发生中神经炎症的调节作用。结果表明,UNC9995不仅可以抑制星形胶质细胞NLRP3炎症小体活化及后续的炎症反应,还能减轻NLRP3炎症小体产物IL-1β引起的神经元死亡,且上述作用依赖于β-arrestin2,提示星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2偏向型通路在PD发生中具有抗炎和神经保护的双重作用,为研发针对神经炎症的新型PD神经保护剂提供了理想的分子靶标。第一部分星形胶质细胞NLRP3炎症小体活化与帕金森病发生的相关性目的:研究NLRP3在帕金森病发生发展中的作用方法:运用野生型(wild type,WT)、NLRP3-/-小鼠制备MPTP慢性PD模型,通过小鼠行为学、脑内神经递质检测、TH阳性神经元与胶质细胞等免疫组织化学检测等,研究NLRP3在PD小鼠模型发生中的作用。结果:1)NLRP3 knockout改善MPTP/p诱导的小鼠运动功能失调;2)NLRP3 knockout减少纹状体单胺类神经递质水平降低；3)NLRP3 knockout减轻中脑SNc区TH+神经元丢失;4)NLRP3 knockout抑制胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及离子钙街头蛋白-1(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)阳性胶质细胞活化；5)NLRP3 knockout抑制血清及BMDM炎症因子分泌;6)NLRP3 knockout抑制中脑NLRP3炎症小体活化及焦亡;7)敲除星形胶质细胞NLRP3可抑制MPP+诱导的神经元损伤。结论:NLRP3敲除可减轻MPTP诱导的小鼠PD样行为学障碍和神经损伤。第二部分星形胶质细胞多巴胺D2受体对NLRP3炎症小体活化的调节及其机制目的:研究、阐明Drd2激动剂对星形胶质细胞NLRP3炎症小体的调节作用及其机制方法:培养小鼠原代星形胶质细胞,给予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)与三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)、尿酸盐(monosodium urate,MSU)、尼日利亚菌素(Nigericin,NIG)刺激,孵育不同浓度Drd2激动剂(LY171555、Quinelorane、Bromocriptine),Western blotting 方法观察细胞上清 IL-1β、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)分泌情况及胞内pro-IL-1β等蛋白水平。细胞免疫荧光观察凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing,ASC)寡聚化光斑。siRNA 分别干扰Drd2、β-arrestin2、β-arrestin1表达,再给予LPS与ATP刺激,孵育LY171555,Western blotting方法观察细胞上清IL-1β、caspase-1分泌情况及胞内pro-IL-1β等蛋白水平。Co-IP及细胞免疫荧光法观察β-arrestin2与NLRP3结合情况。运用WT、β-arrestin2-/-、Drd2-/-小鼠制备MPTP亚急性PD模型,通过TH阳性神经元等免疫组织化学、中脑蛋白水平检测等,研究Drd2激动剂对NLRP3炎症小体活化的抑制及神经保护作用。结果:1)Drd2 激动剂(LY171555、Quinelorane、Bromocriptine)可浓度依赖性地抑制LPS+ATP、LPS+MSU、LPS+Nigericin等多种刺激诱导的星形胶质细胞NLRP3炎症小体活化;2)下调Drd2表达可取消LY171555对NLRP3炎症小体活化的抑制作用;3)β-arrestin2敲除可取消LY171555对NLRP3炎症小体活化的抑制作用;4)Drd2激动剂促进β-arrestin2与NLRP3相互作用,减少ASC与NLRP3的结合;5)Drd2激动剂LY171555逆转MPTP所致的WT小鼠中脑SNc区TH+神经元丢失与胶质细胞活化;6)敲除或中脑立体定位注射干扰β-arrestin2会加剧MPTP所致的神经损伤,并取消Drd2激动剂的神经保护作用。结论:1)星形胶质细胞Drd2抑制NLRP3炎症小体介导的神经炎症,且该作用依赖于β-arrestin2;2)β-arrestin2与NLRP3结合可抑制炎症小体复合物的组装、活化,进而发挥神经保护作用。第三部分 星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2偏向型通路对帕金森病神经炎症的调节及其机制目的:研究星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2偏向型通路对帕金森病发生中神经炎症的调节及其机制。方法:培养小鼠原代星形胶质细胞,孵育UNC9995,CCK8法检测细胞存活率,分离胞浆胞膜蛋白,Western blotting方法观察胞浆、胞膜中β-arrestin2表达。cAMP试剂盒检测UNC9995对cAMP水平的调节。培养C8细胞株,给予LPS刺激与UNC9995孵育,观察UNC9995对IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-6 mRNA水平的影响。小鼠原代星形胶质细胞给予LPS与ATP刺激,孵育不同浓度UNC9995,Western blotting方法观察细胞上清IL-1β、caspase-1分泌情况及胞内pro-IL-1β等蛋白水平。Co-IP及细胞免疫荧光法观察β-arrestin2与NLRP3结合情况。培养SH-SY5Y细胞株,通过LDH水平检测、细胞明场拍摄、Hoechst 33342 染色、AnnexinV/PI 双染、Western blotting 法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma,BCL2)蛋白及Bcl-2相关X 蛋白(Bcl-2 associated Xprotein，BAX)表达水平等方法,研究 UNC9995 对神经元凋亡的影响。Western blotting 法检测 p-IKK/IKK、p-P65/P65、p-JNK/JNK、p-P38/P38水平表达,Co-IP法观察β-arrestin2与IKK、JNK结合情况,研究UNC9995对神经元炎症的影响。运用WT、Drd2-/-小鼠制备MPTP亚急性PD模型,通过TH阳性神经元等免疫组织化学、中脑蛋白水平检测等,研究星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2偏向型通路对PD发生中神经炎症的调节作用。结果:1)UNC9995作用于Drd2-β-arrestin2依赖的信号通路,对G蛋白依赖的信号通路无影响;2)UNC9995抑制LPS+ATP诱导的星形胶质细胞NLRP3炎症小体活化;3)UNC9995促进星形胶质细胞β-arrestin2与NLRP3结合;4)UNC9995抑制NLRP3炎症小体产物IL-1β诱导的SH-SY5Y神经元细胞株凋亡;5)UNC9995抑制IL-1β诱导的神经元NF-kB、JNK、P38炎症通路活化;6)UNC9995抑制MPTP所致的WT小鼠中脑SNc区TH+神经元丢失与胶质细胞活化;7)敲除Drd2能加剧MPTP的神经毒性,且取消UNC9995的神经保护作用。结论:1)选择性激动Drd2-β-arrestin2信号通路可抑制星形胶质细胞NLRP3炎症小体活化及后续的炎症反应;2)星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2偏向型通路可逆转NLRP3炎症小体产物IL-1β引起的神经元死亡,促进神经元存活,减轻PD神经损伤。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.阐明星形胶质细胞Drd2-β-arrestin2非经典通路抑制NLRP3炎症小体活化的作用。2.阐明β-arrestin2是激动星形胶质细胞Drd2抑制神经炎症、发挥神经保护作用的关键分子,为研发β-arrestin2偏爱型先导化合物治疗PD提供分子靶标。