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目的比较体外培养的大鼠脂肪干细胞在平面,微球,支架3种不同培养方式下诱导分化为软骨细胞以及细胞增殖,表型变化等的情况,探讨复合三维支架的优异性。方法选用6周龄健康Wistar大鼠颈椎脱臼法处死,酶消化法分离出脂肪干细胞后体外培养,将Ⅰ型胶原溶液与壳聚糖溶液以7:3的体积比混合后冷冻干燥,交联硫酸软骨素及交联剂后再次冷冻干燥得到胶原-壳聚糖-硫酸软骨素复合三维支架,检测支架的孔径值,含水量及孔隙率等特性后,环氧乙烷灭菌备用。将培养传代后的脂肪干细胞消化下来后分别接种到平面,微球和三维支架3组,软骨诱导培养基定向软骨方向诱导培养。MTT法分别检测第1,3,5,7,14,21天3组细胞的增殖情况,测定各孔的光吸收值,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。倒置显微镜观察平面培养组和微球培养组细胞的形态、生长及分化等情况,扫描电镜观察细胞在支架上的生长,黏附情况,3周后组织学染色观察支架上细胞形态、分布及基质分泌情况,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测基质中Ⅱ型胶原的合成情况。分别于诱导的第14d和21d,用RT-PCR法检测3组细胞Ⅱ型胶原,X型胶原,aggrecan,SOX-9 mRNA的表达情况,分析各个组成软骨分化的情况。结果测定支架的孔径值,含水量及孔隙率适宜,MTT结果显示3种培养方法接种细胞后均增殖,MTT检测值均有不同程度的升高。第5d开始三维支架组及微球组MTT检测发现细胞增殖速度明显比平面培养组快,差距有统计学意义,三维支架组14d后仍有细胞的进一步增殖,而微球组则进入平台期;倒置显微镜观察定向软骨细胞方向诱导后,平面培养组和微球培养组可见细胞逐渐变成圆形。扫描电镜观察,1周时可见大量细胞附着在支架上,细胞形态呈扁平状,细胞周围有大量基质分泌,3周时细胞在复合支架上密集重叠生长,并相互被基质包埋,布满支架的孔隙内,支架本身结构己无法清晰显示。组织学H-E染色显示细胞在支架上密集重叠生长,内层仍有残留支架结构,Ⅱ型胶原免疫组化结果显示,3组细胞均有阳性表现,但三维支架组及微球组表达强阳性而平面组表达弱阳性。RT-PCR结果显示各组均有软骨特异性mRNAⅡ型胶原,aggrecan和SOX-9的表达,但平面组一直表达软骨过度分化的标志X型胶原,微球组培养至21d时也表达X型胶原,而三维支架组则一直未表达。结论本试验构建的三维支架本身参数良好,各个检测结果显示三维支架培养比微球培养和平面培养更能促进细胞的增殖、分化,并能更好的维持软骨细胞的表型,可以作为组织工程构建软骨的最佳选择之一。