肠球菌是一类球形或卵圆形,呈对或短链存在,广泛存在于水、土壤等环境中,是人和动物体胃肠道正常菌群之一。肠球菌对人和动物致病主要通过黏附,侵袭以及组织损伤实现。通过黏附和肠黏膜的上皮细胞以及胞外基质结合起来,占位定植,进而侵入到机体内部,对宿主发挥生物屏障功能,最终引发组织损伤。而在肠球菌的众多毒力因子中,肠球菌胶原蛋白黏附素ace是肠球菌分泌于菌体表面的一种黏附素,在菌体生物膜形成过程中起重要作用,有良好的黏附活性。本研究通过对毒力因子Ace的研究,希望能对肠球菌的致病机理以及临床防治粪肠球菌的感染提供理论依据。根据GenBank中发表的肠球菌毒力因子Ace的基因序列,设计出一对ace基因的特异性引物,以粪肠球菌的DNA为模板,PCR扩增出1358bp的目的片段,经胶回收纯化后和载体pTG19-T相连接,转化入大肠杆菌DH5α中,经PCR扩增,酶切鉴定,证明成功构建出重组载体。对实验室保存的从河南省各大猪场分离的43株分离菌以及3株标准菌株进行ace基因PCR扩增,以检测菌株中ace基因的携带率及其保守性,结果显示,共有30株菌株扩出ace基因,携带率为71.7%,同时对这46株菌进行同源比对,同源性达98.6%-100.0%。说明毒力因子Ace在肠球菌中存在较为广泛,且.基因序列高度保守,可针对此对肠球菌Ace做进一步研究。本研究运用同源重组的方法构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素ace基因缺失突变株。首先,通过PCR扩增ace基因并引入酶切位点,经双酶切及PCR验证后回收目的片段。同时对自杀质粒pK18mobSacB双酶切和PCR验证,后经T4连接酶作用下转化入宿主菌DH5α,构建出带有kan卡那霉素抗性标志的Pk18-ace-kan,经PCR以及酶切验证后,送往基因测序公司测序,并对序列进行比对。测序正确的质粒经去离子后电转化入粪肠球菌野生株ATCC29212中,根据同源重组原理,筛选出突变株,提取出突变株的基因组DNA,用带有抗性标记的kan基因标记探针,对突变株的基因组DNA进行Southern blot杂交,来证实ace基因是否已经成功被敲除。经过多次的克隆转化,PCR扩增,Southern blot分析,结果表明已成功获得1株ace基因缺失突变株,命名为ATCC29212 ΔAce::kan,且经过Southern blot杂交,证明ace基因已被成功敲除,插入kan基因,使ace基因不能正常表达。转化成功后,分别对野生株和突变株进行细菌黏附和生物被膜试验的比较,分析突变株的生物学特性,以期研究突变株对细菌黏附和生物被膜形成的改变情况。细菌黏附试验的比较结果显示,ace基因缺失菌株对宿主菌的黏附性明显减弱,而在生物被膜试验中,ace基因缺失突变株的生物膜形成能力也减弱。综上所述,对从河南各大猪场分离的43株菌株以及3株粪肠球菌标准菌株扩增检测,得出ace基因的携带率较高。本研究通过同源重组的方法成功构建出ace基因的突变株ATCC29212ΔAce::kan。经Southern blot杂交证明突变成功。生物膜试验以及黏附试验表明,ace基因的缺失可能引发菌体对宿主的致病力降低,这为寻找新型的抗菌药物以及防控粪肠球菌的感染提供了新策略。