本研究选用质粒pGAPZαA作为载体构建含目的基因的重组表达质粒pGAPZαA-CMTI Ⅰ,并通过PCR、酶切鉴定以及DNA测序后,将阳性重组子进行大量的培养扩增,抽提质粒,经Bln Ⅰ酶切线性化后电击转化进入表达载体巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)GS115中.转化后在含抗生素Zeocin的低盐YPDS培养基上进行平板筛选,获得20个具有抗性的菌落,通过对这20个菌落表达上清进行Tricine-SDS-PAGE筛选获得高表达菌株1个.Tricine-SDS-PAGE结果显示,阳性重组菌的表达产物较空白菌在3.0kD处有一条明显的rCMTI Ⅰ条带,占分泌蛋白总量的6.21%,表达量为609mg/L.采用亲和分离技术对重组表达产物rCMTI Ⅰ进行了分离纯化.首先制备了壳聚糖多孔珠,并以戊二醛为交联剂将胰蛋白酶交联于其上获得了亲和吸附剂,还考察了壳聚糖多孔珠以及壳聚糖多孔珠亲和吸附剂的性质.然后用所制备的亲和吸附剂采用静态吸附和洗脱方式从含有表达产物的培养基中直接分离纯化rCMTI Ⅰ.最后通过Sephadex G-10层析对获得的洗脱液冷冻干燥品进行脱盐和进一步纯化,获得了基本纯化的rCMTI Ⅰ.经Tricine-SDS-PAGE分析,纯化rCMTI Ⅰ的分子量约为3.2kD,与文献报道的CMTI Ⅰ的分子量一致.纯化产物具有抑制胰蛋白酶活性的作用.本论文还对rCMTI Ⅰ的相关性质进行了研究.研究证明rCMTI Ⅰ为胰蛋白酶的非竞争性可逆性抑制剂,其抑制常数Ki为4.52×10<-7>mol/L;rCMTI Ⅰ对热较稳定,在80℃和在100℃条件下作用30min仍能保持92.16%和85.51%的抑制活力;rCMTI Ⅰ对pH值稳定,在pH 1~10的范围内于室温下放置10min其抑制活力基本不变;rCMTI Ⅰ除了对胰蛋白酶具有抑制作用外,还对胰凝乳蛋白酶和透明质酸酶具有抑制作用,进一步证明了其丝氨酸蛋白酶抑制特性及其潜在的临床应用价值.