1.研究目的和意义视网膜细胞的损伤是导致视力下降的重要因素,对于视网膜细胞的修复和再生的研究将为临床提供基础理论支持。干细胞是一种具有自我更新并能产生多种成熟细胞类型的细胞,它具有对称分裂和不对称分裂两种方式,其子细胞仍保持多潜能和干细胞特性。神经干细胞亦是多潜能干细胞,能够分化为各种神经细胞类型,包括神经细胞、星形胶质细胞和少突细胞。视网膜干细胞是在发育过程中能够产生各种视网膜细胞类型、具有自我更新能力的多潜能中枢神经系统的前体,它们存在于各种脊椎动物胚胎眼杯中,在低等脊椎动物的生命过程中保持活性。所有脊椎动物的视网膜都是由七种主要的细胞类型组成,包括神经节细胞、视椎细胞、视杆细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞和Mnller细胞。视网膜干细胞发育分化为不同的视网膜神经元,有着严格的、规律的发育次序,在视网膜的发育过程中首先产生神经节细胞,其后为视椎细胞和无长突细胞,水平细胞在一些物种(鸡和哺乳类动物)是随后产生,而在另一些动物(鱼和两栖类动物)稍晚些产生,然后产生视杆细胞,大部分双极细胞和Muller细胞是在视网膜神经形成的最后阶段产生。虽然视网膜神经元的发育次序是固定的,但是在不同的细胞类型发育过程中有相当大一部分是相互交替重叠的。视网膜神经元的分化是由中央到周边的顺序,最接近中央视网膜的细胞首先产生和分化,而后是周边部的视网膜细胞发育分化。大量文献已详细报道视网膜的神经发生和分化,并以大量物种为模型来研究视网膜及视觉系统的发育,其发生发展具有其相对独特的特征。然而,在以往的文献报道中在成年哺乳类动物中不存在视网膜干细胞活性,视网膜没有生长或再生能力。直到2000年,Tropepe等在成年小鼠、大鼠、牛和人类视网膜睫状缘区(Ciliary marginal zone,CMZ)鉴定出视网膜干细胞,发现睫状缘色素上皮细胞(pigmented cells from ciliary margin,PCM)在体外通过无性繁殖增殖形成神经球,能够分化为视网膜多种特定细胞类型,包括光感受器杆状细胞、双极神经元、Muller神经胶质细胞。发育成熟的视网膜干细胞定位于睫状色素上皮边缘,不存在于中央及周边部视网膜色素上皮,这些细胞各层在形态学上是与其他非哺乳类脊椎动物胚胎眼区的结构相一致的。目前被公认较理想的神经干细胞标记物是中间丝蛋白Nestin,Nestin是一种未成熟神经上皮细胞的细胞骨架成分,研究者发现Nestin可用于在体外鉴定具有高度可塑性的神经祖细胞的存在。Nestin的细胞作用还不甚明了。Nestin最初被发现特异表达于神经上皮干细胞中,它是神经系统发育早期神经上皮干细胞表达的一种神经丝蛋白,目前被广泛作为鉴定神经干细胞的特异性标记。然而在很多组织中如发育中的肌肉组织、新形成的内皮细胞、肝脏星形细胞、胰腺导管细胞等也有Nestin的表达。目前国内外对视网膜干细胞的研究多是从视网膜干细胞的分离、培养、鉴定入手,观察其增殖分化能力,而对其存在部位、数量多少随种系的发育有否变化研究甚少。本研究选用SD(sprague Dawley)大鼠为研究对象,采用免疫组化与流式细胞术等实验技术,通过观察Nesfin在SD大鼠出生后的不同发育阶段的眼内表达变化,了解视网膜干细胞存在部位及其数量变化。随着SD大鼠出生后年龄增长,研究Nestin的表达变化与SD大鼠出生后的视网膜神经细胞发育的关系,同时观察Nestin不仅在SD大鼠视网膜表达外,在SD大鼠眼部其他组织是否也有表达,其表达量的变化是否与在视网膜的表达变化具有一致性。2.材料和方法2.1 Nestin在出生后SD大鼠发育不同阶段的视网膜表达变化通过免疫细胞化学方法及流式细胞术方法,检测Nestin在SD大鼠视网膜的阳性表达。2.1.1选取出生一天、三天、五天、一周、两周、三周、一个月SD大鼠各4只,雌雄不限,断颈处死,沿颈部将头剪下,将眼险及头部皮肤完全剪除,角膜做“十”型剪开,将SD大鼠头颅放入FAA液中固定12小时后,将晶体及玻璃体挑出,继续在FAA液中固定2-3天,4℃冰箱保存。出生一周以上的大鼠头颅标本需脱钙一周处理,沿头颅正中做矢状位切开,剪除多余组织,修剪成带眼眶组织的眼球材料各8只,分别入60%、70%、80%梯度酒精中脱水各30分钟,90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精中脱水各20分钟,标本放入二甲苯中10分钟,松节油中透明24小时,入70℃电热恒温箱中的石蜡罐Ⅰ、Ⅱ中各1小时后行石蜡包埋,制成蜡块,切片分别行HE染色和免疫组化染色。免疫组化检测Nestin在视网膜的表达,光镜下观察阳性细胞的显色程度、分布范围及密度,阳性细胞表现为棕黄色颗粒状胞浆着色。(-):阴性,无表达;(+):着色浅,呈淡黄色、分布范围小,高倍镜下明确阳性:(++):着色中等,棕黄色,低倍镜下明确阳性;(+++):着色大量,棕色,着色深;(++++):着色密集片状,深棕色,着色强烈。免疫组化切片应用日本Nikon E800显微镜在40倍物镜下随机选取6个高倍视野进行图像采集,美国IPP(Image-proplus)图像分析软件进行图象分析,记录全部Nestin阳性细胞数量。2.1.2选取出生一天、三天、五天、一周、两周、三周、一个月SD大鼠各8只,雌雄不限,断颈处死,沿颈部将头剪下,将眼睑及头部皮肤完全剪除,沿角膜缘向玻璃体腔内注射Ⅳ型胶原酶约0.1ml消化视网膜约30分钟,角膜做“十”型剪开,挑出晶体和玻璃体,用带有Ⅳ型胶原酶的注射器反复冲洗出视网膜,反复吹打洗涤,低速离心,抗体标记,进行流式细胞仪机检。2.2 Nestin在出生后发育不同阶段SD大鼠眼肌的表达变化标本按时间分组取材、免疫细胞化学方法及图象分析方法均与第1部分相同。各组数据结果以均数±标准差((?)±s)表示,采用SPSS11.0统计软件对数据进行统计分析,各组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较用Student-Newman-Keuls(SNK)法,如果方差不齐用Tamhane法,以P＜0.05为有显著性差异。3.结果3.1 Nestin在出生后SD大鼠发育不同阶段的视网膜表达变化3.1.1免疫组化切片显示SD大鼠自出生后一天、三天、五天、七天、两周、三周、一个月组视网膜Nestin阳性表达为胞浆棕黄色着色。出生后一天、三天组SD大鼠视网膜各层均有阳性表达,表达量多。一天组8只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达均为++++,三天组6只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为++++、2只表达为+++;五天、七天组阳性表达在视网膜色素上皮层、神经节细胞层、神经纤维层表达量多,内核层表达较多,外核层、视杆视锥细胞层均少量表达。五天组7只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为+++、1只表达为++,七天组6只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为+++、2只表达为++;两周组在神经纤维层有中等量表达,内核层阳性表达少见,5只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为++、3只表达为+;三周组在神经纤维层有少量表达,内核层偶见,6只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为+、2只表达为一;一个月组仅在神经纤维层偶有表达,其余各层未见阳性表达,4只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为+、4只表达为-。各时期阴性对照组视网膜Nestin均为阴性表达。3.1.2图象分析结果显示一天、三天、五天、七天、两周、三周、一个月组视网膜Nestin阳性细胞数量分别为3197.67±401.16、2649.17±517.84、1513.00±148.38、1510.50±151.91、510.83±132.24、156.33±40.30、21.33±10.78。各组间比较:除一天组与三天组、五天组与七天组比较P＞0.05,差异无显著性意义,其余各组间两两比较均为P＜0.05,均有显著性差异。3.1.3流式细胞仪检测流式细胞仪机检视网膜细胞计数,一天、三天、五天、七天、两周、三周、一个月组视网膜Nestin阳性细胞表达占细胞总数的比例分别为11.77±1.75%、9.48±0.96%、7.83±0.23%、6.75±1.09%、3.48±0.42%、2.43±0.40%、0.85±0.28%。阴性对照组为0.06±0.02%。3.2 Nestin在出生后发育不同阶段SD大鼠眼肌的表达变化3.2.1免疫组化切片显示SD大鼠除视网膜外在眼外肌中也可见胞浆棕黄色着色的Nestin阳性表达,随SD大鼠的发育,Nestin在眼外肌中的表达量逐渐减少,由++++、+++、++、+至-不等,由出生后一天大量表达到一个月时基本未见阳性表达。一天组6只SD大鼠眼外肌Nestin阳性表达为++++、2只表达为+++:三天组4只SD大鼠眼外肌Nestin阳性表达为++++、3只表达为+++,1只表达为++;五天组7只SD大鼠眼外肌Nestin阳性表达为+++、1只表达为++;七天组5只SD大鼠视网膜Nestin阳性表达为+++、3只表达为++;两周组3只SD大鼠眼外肌Nestin阳性表达为++、5只表达为+;三周组4只SD大鼠眼外肌Nestin阳性表达为+、4只表达为-;一个月组8只SD大鼠眼外肌Nestin均为阴性表达。3.2.2图象分析结果显示一天、三天、五天、七天、两周、三周、一个月组SD大鼠眼外肌Nestin阳性细胞数量分别为905.00±149.98、701.17±124.64、558.67±108.88、453.67±95.51、265.50±110.90、91.83±22.92、0。除五天组与七天组比较P＞0.05,差异无显著性意义,其余各组间两两比较均为P＜0.05,差异有显著性意义。4.结论4.1检测大鼠自出生后一天、三天、五天、七天、两周、三周、一个月等不同时段Nestin表达量,本实验显示,SD大鼠自出生后一天、三天、五天、七天、两周、三周、一个月随时间变化,视网膜Nestin阳性表达均有明显变化,由分布在视网膜各层到仅在神经纤维层偶有表达,视网膜干细胞Nestin阳性表达量逐渐减少,免疫组化图像分析及流式细胞术的结果均有一致的变化趋势。出生后大鼠随年龄增长,视网膜干细胞Nestin阳性表达量逐渐减少。4.2 Nestin不仅在视网膜中有阳性表达,同时标记出Nestin在眼球外的眼外肌部位亦有阳性显示,且随大鼠的发育表达量逐渐减少,至出生一个月时基本未见阳性表达。4.3 SD大鼠视网膜神经干细胞在出生后不同时段的Nestin表达量的变化与肌细胞表达量的变化,具有相当的一致性。